RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

EFFETTI NON EMOSTATICI DELLA TROMBINA: INTERAZIONE CON FATTORI DI CRESCITA, E SUO RUOLO NELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE, IN PROCESSI NEURODEGENERATIVI E IN CONDIZONI DI ALTERATA PERMEABILITA' VASALE

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - MEDICINA INTERNA - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Marco CICARDI

Descrizione

Il nostro gruppo di ricerca ha acquisito una notevole esperienza nel campo della neuroprotezione mediante l'utilizzo di sostante antinfiammatorie quali C1-inibitore (Bergamaschini et al., 2001c; Bergamaschini et al., 2001b; Bergamaschini and Cicardi, 2003; De Simoni et al., 2003; De Simoni et al., 2004), eparina nativa e frazionata (Bergamaschini et al., 1999; Bergamaschini et al., 2002; Bergamaschini et al., 2004).
1) C1-inibitore è una glicoproteina plasmatica che appartiene alla superfamiglia degli inibitori delle serin proteasi (serpine). E' l'unico inibitore delle proteasi del complemento C1s e C1r, regola la generazione di chinine attraverso l'inibizione del fattore XIIa e della callicreina, e la via intriseca della coagulazione inibendo il fattore XIa. E' stato dimostrato che in vitro C1-inibitore inibisce anche la plasmina, l'attivatore tissutale del plasminogeno e la trombina in vitro (Zahedi et al., 2001; Cai and Davis, 2003; Davis et al., 2004).
Nel corso degli anni molto si è appreso sulla struttura, gli aspetti genetici (Cicardi et al., 1987; Ariga et al., 1989; Aulak et al., 1990; Levy et al., 1990; Aulak et al., 1993; Davis et al., 1993; Bissler et al., 1994), lo spettro inibitorio ed il meccanismo d'azione di questa proteina(Zahedi et al., 1993; Cai and Davis, 2003); recentemente è stato dimostrato che il legame di C1-inibitore con le cellule endoteliali potrebbe costituire un evento cardine per le sue attività biologiche. Il nostro gruppo ha dimostrato con esperiementi in vivo e in vitro che C1-inibitore si fissa all'endotelio (tramite legame con selectine e glicosoaminoglicani di membrana) conservando la capacità inibente (Bergamaschini et al., 2001b). In un modello animale di ischemia cerebrale transitoria abbiamo dimostrato che l'effetto neuroprotettivo non dipende esclusivamente dall'inibizione della via classica del complemento, coinvolgendo l'inibizione del sistema delle chinine e probabilmente la trombina (Bergamaschini et al., 2001c; Bergamaschini et al., 2001b; De Simoni et al., 2003; De Simoni et al., 2004). Riteniamo di notevole interesse valutare il ruolo di C1-inibitore legato all'endotelio nella modulazione dell'attività vasopermeabilizzante proinfiammatoria della trombina.
Recentemente sono stati studiati gli effetti dell'interazione di C1-inibitore e trombina sia in un sistema purificato che nel plasma intero, dimostrando che parte di C1-inibitore forma complessi stabili con la trombina e parte viene da questa inattivato(Cugno et al., 2001). Studi di cinetica hanno dimostrato che la costante di inibizione aumenta in modo significativo in presenza di eparina. Pertanto il ruolo di C1-inibitore nel controllo dell'attività trombinica potrebbe essere molto importante a livello endoteliale, dove in condizioni di stress aumenta in modo considerevole l'espressione di molecole di adesione ed eparansolfati. Dati preliminari sembrano confermare che in presenza di cellule endoteliali l'attività antitrombinica di C1-inibitore aumenta.
Tutti i membri della superfamiglia delle serpine condividono una struttura terziaria comune che consiste in una parte centrale di circa 400 amino acidi dominata da un ampio foglietto-beta ed in un segmento peptidico esposto al solvente contenente il sito reattivo costituito dal legame peptidico P1-P1' (RCL). Le serpine regolano l'attività degli enzimi proteolitici agendo come pseudo-substrati che inizialmente si legano ai loro enzimi bersaglio attraverso il RCL e quindi vengono indotte per clivaggio da parte della proteasi a un cambiamento conformazionale che intrappola l'enzima in un legame altamente stabile. Da quando si scoprì che un mutante naturale della serpina archetipo alfa1-antitripsina aveva attività antitrombinica e non anti-elastase, la sua proteasi bersaglio fisiologica, nacque l'interesse a disegnare mutanti serpinici con specificità per particolari enzimi. In questo contesto è nostra intenzione ottenere un C1-inhibitore con una maggior capacità di inibire la trombina, pur conservando la capacità di legame con le cellule endoteliali. La trombina ha una stretta specificità per la carica positiva di Arg in P1, benché anche i residui P2 e P3 contribuiscano significativamente alla specificità del riconoscimento. I residui in posizione P3-P2-P1 di C1-inibitore sono Val-Ala-Arg: poiché studi con substrati peptidici sintetici indicano Val-Pro-Arg come i residui ottimali per il riconoscimento primario della trombina, il nostro primo tentativo sarà quello di modificare il residuo in posizione P2 da Ala a Pro.

2) L'eparina nativa e le eparine a basso peso molecolare non solo sono un importante inibitore della trombina, ma posseggono attività antinfiammatoria e anti-amiloidogenetica (Tyrrell et al., 1999). Recentemente abbiamo dimostrato che la somministrazione di enoxaparina (eparina a basso peso molecolare) ad animali che iper-esprimono Aβ umana a livello cerebrale comporta una significativa riduzione del deposito della stessa, dell'attivazione gliale e astrocitaria. Il meccanismo per tale effetto neuroprotettivo potrebbe essere riconducibile alla capacità dell'eparina di ridurre l'attivazione del complemento e del sistema delle chinine da parte di Aβ, e della capacità di competere con Aβ per il legame agli eparansulfati della matrice extracellulare(Bergamaschini et al., 2001a; Bergamaschini et al., 2002; Bergamaschini et al., 2004). L'eparina, in ragione della complessità della formulazione farmacologia, potrebbe comunque svolgere la sua azione protettiva agendo su molti altri fattori potenzialmente coinvolti nella patogenesi del decadimento cognitivo, non ultimo l'effetto antitrombinico (Engelberg, 2004).

E' interessante notare come sia C1-inattivatore e eparina si leghino sulla membrana delle cellule endoteliali, e questo sembra aumentarne l'attività biologica. Ci sembra quindi interessante valutare se in presenza di cellule endoteliali, C1-inattivatore e eparina potenzino l'un l'altro l'attività biologica. Questa eventualità potrebbe essere sfuttata dal punto di di vista terapeutico per proteggere il cervello da insulti sia di tipo degenerativo che infiammatorio.

Per valutare tale ipotesi ci proponiamo di:
1. valutare gli effetti della presenza di C1-inattivatore, rC1-inattivatore e dell'eparina sulla membrana di cellule endoteliali in coltura per definire il ruolo di tali inibitori della trombina nella regolazione della sua attività biologica inclusa la capacita di aumentare la permeabilità dell'endotelio alle macromolecole.
2. valutare la possibilità di ottenere C1-inattivatore ricombinate recante una mutazione nel sito reattivo con aumentata attività antitrombinica, conservando la capacità di fissarsi all'endotelio e le altre attività anti-inmfiammatorie,

APPROCCIO METODOLOGICO
Espressione di C1-inibitore ricombinate(rC1-INH) in Pichia pastoris.
Per l'espressine in lievito di rC1-INH il cDNA è stato clonato nel vettore di espressione pPICZalfa. Questo vettore è stato specificamente costruito per la secrezione della proteina ricombinante nel supernatante. Le mutazioni verranno inserite nel gene di C1-INH mediante PCR. Le cellule di lievito verranno transfettate e trattate secondo il protocollo della casa distributrice. La tecnica attualmente in uso nel nostro laboratorio ci ha permesso di ottenete circa 180mg/l di rC1-INH. Il supernatante delle colture sarà concentrato e rC1-INH purificato con tecnica cromatografica in fase liquida (Mono S, Amersham). Il grado di purezza del preparato sarà confermato con elettroforesi in gel di acrilamide (SDS-PAGE) e western-blotting, mentre la concentrazione del preparato sarà determinata con tecnica ELISA. Come proteina di controllo si utilizzerà C1-INH purificato da plasma umano secondo la tecnica descritta da Pilade et al.(Pilatte et al., 1989).

Preparazione di cellule endoteliali umane.
Colture primarie di cellule endoteliali umane (HUVEC) saranno allestite partendo da cordoni ombelicali conservati in soluzione salina sterile per non più di 24-48 dal travaglio per via vaginale. La vena ombelicale sarà incanalata, lavata con PBS sterile, e le cellule endoteliali saranno staccate mediante digestione con 0.2g/L di Collagenase A (Calbiochem) per 30 min. a 37°C. Le cellule così ottenute saranno lavate e pilastrate in fiasche per colture cellulare (Falcon, Licoln Park, NJ) pretrattate con Gelatina (SIGMA). Le cellule saranno incubate a 37° in ambiente umido in presenza di C02 5%. Il medium di coltura sara così costituito: Medium 199 contenente HEPES (20mM) pH 7.6, L-glutammina (20mM), gentamicina ( 10mg/L), eparina sodica (5U/L), siero bovino 20%, fattori di crescita ottenuti da cerevello bovino (50mg/L). le colture di HUVEC saranno successivamente moltiplicate mediante digestione con tripsina/EDTA, e saranno utilizzate per i vari esperimenti dopo 3-10 passaggi. Il fenotipo cellulare sarà determinato con tecnica immunoistochimica utilizzando anticorpo policlonale anti fattore vW/fattore VIII. Prima dell'utilizzo negli esperimenti la vitalità cellulare sarà determinata misurando la capacità di convertire MTT in formazano, e determinando il contenuto cellulare di LDH.

Legame di C1-INH e rC1-INH sulle cellule endoteliali in coltura.
HUVEC saranno fatte crescere in piastre da 96 pozzetti trattati con gelatina, dopo ripetuti lavaggi con PBS saranno incubate con differenti quantità di C1-INH e rC1-INH per 12 ore. Poiché c1-INH e rC1-INH si può legare sia a eparansolfato che alle selectine espresse sulla membrana cellulare, saranno effettuati anche esperimenti nei quali le HUVEC saranno trattate con eparinase o con anticorpo monoclinale anti selectina e prima di essere incubate con C1-INH o rC1-INH. Per determinare l'efficacia del legame, le HUVEC saranno lavate, fissate con paraformaldeide (4%) e quindi con anticorpo policlonale anti C1-INH perossidasi coniugato.

Inibizione dell'attività della trombina da parte di C1-INH e rC1-INH legati alle HUVEC.
Le HUVEC saranno fatte crescere in piastre da 96 pozzetti protrattati con gelatina. Una volta raggiunta la confluenza le cellule saranno incubate con C1-INH o rC1-inh per 12-24. Alla fine dell'incubazione il sopranatante sarà eliminato e le cellule lavate. Trombina sarà aggiunta nei pozzetti e la residua attività sarà valutata misurando da capacità di digestione di uno specifico substrato cromogenico.

Inibizione dell'attività della trombina da parte di enoxaparina.
Le HUVEC a confluenza in piastre da 96 pozzetti trattati con gelatina saranno esposte a enoxaparina per 12-24 ore. La capacità di inibire la trombina sarà valutata come sopra riportato.

Inibizione del rilascio di APP indotto dalle trombina.
Le HUVEC a subconfluenza in fiasche da 25 cm2 trattate con gelatina saranno trattate con C1-INH, rC1-INH o enoxaparina per 12-24 ore. Le cellule dopo essere state lavate più volte saranno esposte a α-trombina o con l'inibitore della trombina AGBA (SIGMA) o con l'inibitore della precallicreina bis-indolil-maleimidico (Calbiochem) in presenza di medium privo di siero. Ulteriori esperimenti saranno condotti esponendo le HUVEC all'attivatore del recettore trombinica (TRAP, Calbiochem). A differenti tempi di incubazione il sopranatante sarà recuperato, concentrato, sottoposto a separazione elettroforetica in gel di poliacrilamide (SDS-PAGE), trasferito su membrana che sarà trattata con anticorpo monoclonale anti-APP e anticorpo secondario perossidi coniugato. APP sara visualizzata con tecnica di chemoluminescenza. Dopo analisi densitometrica delle bande, i valori saranno espressi come percentuale di APP da HUVEC trattate con inibitori trombinici versus APP da HUVEC non trattate.

Test di permeabilizzazione endoteliale.
Le HUVEC saranno fatte crescere fino alla confluenza in apposite camere a fondo semipermeabile (Transwell, Costar). Il passaggio di tracciante perossidato o fluorescinato (45-60kDa) dopo trattamento con trombina sarà valutato utilizzando HUVEC non trattate, o trattate con C1-INH, rC1-INH o enoxaparina. Il passaggio del tracciante sarà monitorizzato per 30 min. Il flusso del tracciante sarà convertito in unità arbitrarie di permeabilità. Saranno condotti esperimenti preliminari per stabilire il fisiologico coefficiente di permeabilità delle HUVEC in monostrato.