RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

EFFETTI NON EMOSTATICI DELLA TROMBINA: INTERAZIONE CON FATTORI DI CRESCITA, E SUO RUOLO NELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE, IN PROCESSI NEURODEGENERATIVI E IN CONDIZONI DI ALTERATA PERMEABILITA' VASALE

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - SCIENZE FARMACEUTICHE - PADOVA(PD)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Vincenzo DE FILIPPIS

Descrizione

La trombina è una proteasi serinica, appartenente alla famiglia della chimotripsina e caratterizzata dalla presenza di due domini a struttura prevalente di tipo beta. Il sito catalitico è situato all'interfaccia tra i due domini strutturali. Rispetto alla chimotripsina, con la quale mostra elevata omologia strutturale e di sequenza, la trombina presenta numerosi loop di inserzione, responsabili della sua peculiare specificità di substrato [40]. Inoltre, essa contiene due esositi (I e II) mediante i quali l'enzima interagisce con numerosi effettori. Questi esositi sono localizzati su regioni opposte della trombina e sono caratterizzati dalla presenza di un numero elevato di amminoaci basici [40]. L'esosito I è coinvolto nel legame della trombina al fibrinogeno, al PAR-1, alla trombomodulina, nonché ad inibitori endogeni, come il fattore eparinico II, ed esogeni, come la coda C-terminale dell'irudina [6, 40]. L'esosito II rappresenta il sito di legame per l'eparina, per il frammento F2 della protrombina e per inibitori fisiologici, come l'antitrombina III e la nexina-1 [6, 40]. Inoltre, l'esosito II è coinvolto nel legame alla regione N-terminale 1-282 della glicoproteina Ib (GpIb) sulla superficie delle piastrine [41], ed alla coda C-terminale dell'emadina [42], un inibitore isolato dalla sanguisuga Haemadipsa sylvestris. A differenza della chimotripsina, l'attività proteolitica della trombina è aumentata dal binding specifico di Na+ [6], che stabilizza l'enzima in una conformazione più aperta e rigida [9]. E' interessante notare che alcune delle molteplici attività della trombina non sono legate alla sua azione proteolitica. Ad esempio, la funzione chemiotattica e stimolate dei macrofagi è indipendente dall'attività proteolitica dell'enzima, ma è associata alla sequenza amminoacidica che specifica il sito di riconoscimento S2 dell'enzima [43].
Le informazioni ampiamente riportate nella Base di Partenza Scientifica di questo Progetto di Ricerca dimostrano un coinvolgimento importante della trombina in numerosi processi fisiologici e patologici, tra cui emostasi e trombosi, infiammazione e chemiotassi, proliferazione cellulare e crescita tumorale, angiogenesi e malattie neurodegenerative. Questi dati suggeriscono la presenza di una stretta "comunicazione biochimica" tra i vari meccanismi che regolano i differenti effetti cellulari della trombina. Tuttavia, le basi molecolari, cioè gli elementi costitutivi di questa "comunicazione", sono per la maggior parte sconosciute. E' noto, ad esempio, che la trombina è capace di evocare numerose risposte cellulari mediante un meccanismo che prevede l'attivazione dei recettori di tipo PAR. E' altrettanto evidente, però, che questo meccanismo non può spiegare da solo l'attività pleiotropica di questo importante enzima. Inoltre, dal punto di vista fisiologico ed evolutivo, è raro che delicate funzioni cellulari siano regolate attraverso un solo meccanismo molecolare.
L'obiettivo generale di questo Progetto di Ricerca è quello di studiare l'interazione in vitro della trombina con potenziali nuove molecole bersaglio, coinvolte in processi angiogenici e in malattie neurodegenerative. Tale studio si avvarrà delle metodologie e strumentazione già disponibili nel nostro Laboratorio, nonchè della stretta collaborazione con le altre Unità di Ricerca. La nostra Unità di Ricerca ha maturato una solida esperienza nella chimica delle proteine (e.g., sintesi di peptidi, analisi sequenziale di proteine, nanobore HPLC, spectrometria di massa e HPLC-MS), nella caratterizzazione conformazionale e nello studio dell'interazione proteina-protein (e.g., spettroscopia di fluorescenza, dicroismo circolare, FT-IR, scambio idrogeno/deuterio). Queste tecniche saranno potenziate ed estese con l'acquisizione di un sistema stopped flow e di titolazione calorimetria, per cui si richiede il finanziamento in questo Progetto. I risultati di questi studi contribuiranno alla comprensione dei meccanismi molecolari responsabili delle molteplici funzioni della trombina e a delineare nuove strategie terapeutiche nella cura di malattie cardiovascolari e neurodegenerative.

Le attività di ricerca saranno articolate nei seguenti punti:
1. Studio dell'interazione della trombina con FGF e sui analoghi strutturali
2. Studio dell'interazione della trombina con peptidi di beta-amiloide
3. Interazione della traombina con fattori di crescita vascolari e neuronali: NGF, PDGF, BDNF e VEGF
4. Interazione di Trombina con alfa-sinucleina
5. Proprietà amiloidogeniche intrinseche di Protrombina e Trombina

STUDIO DELL'INTERAZIONE DELLA TROMBINA CON FGF E SUI ANALOGHI STRUTTURALI. Studi preliminari, condotti dall'Unità di Ricerca di Roma, hanno dimostrato che la trombina idrolizza in più punti l'FGF, annullandone le proprietà mitogene su cellule HUVEC [22]. Verranno condotti esperimenti di proteolisi limitata di FGF-b con concentrazioni fisiologiche di trombina, in diverse condizioni sperimentali di pH, temperatura e cosolventi organici. I siti di idrolisi di FGF-b da parte della trombina verranno identificati mediante analisi della sequenza N-terminale, effettuata con sequenziatore automatico di proteine, e mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione. Verranno prodotti, mediante sintesi chimica su fase solida, peptidi sintetici corrispondenti ai siti di idrolisi di FGF-b, precedentemente determinati. Tali peptidi sintetici verrano forniti all'Unità di Ricerca di Roma (Prof. Landolfi), dove saranno utilizzati per determinare le costanti cinetiche per l'idrolisi di FGF-b da parte della trombina.
Considerando che in condizioni fisiologiche la forma procoagulante (fast) ed anticoagulante (slow) della trombina sono ugualmente popolate [6], verrà valutato l'effetto dello ione Na+ sull'efficienza di idrolisi dell'FGF-b da parte della trombina, in condizioni sperimentali in cui l'enzima esiste prevalentemente (> 90%) in forma fast (25°C, pH 8.0 e 0.2 M NaCl) o in forma slow (25°C, pH 8.0 e 0.2 M colina cloruro) [6]. L'efficienza di frammentazione verrà stimata mediante tecniche cromatografiche (RP-HPLC) ed elettroforetiche (SDS-PAGE).
Al fine di determinare i siti della trombina (oltre quello catalitico) coivolti nell'interazione con l'FGF, verrà valutata l'efficienza di idrolisi dell'FGF-b in presenza di ligandi specifici per l'esosito-I (e.g., frammento 48-64 dell'irudina) e l'esosito-II (e.g., il frammento 45-57 dell'emadina), che sono già stati sintetizzati nel nostro Laboratorio. La capacità della trombina di idrolizzare l'FGF-b verrà valutata in presenza di PDGF, che è noto interagire con ed inibire l'attività di FGF-b [24].
E' noto che sia l'FGF-b che la trombina legano eparina. Verrà valutata la capacità della trombina di idrolizzare l'FGF-b in presenza di eparina.
Dal punto di vista strutturale, l'FGF-b è una proteina basica che presenta una struttura a piramide trigonale, con un contenuto prevalente di struttura secondaria di tipo beta [45]. E' interessante notare che, nonostante esista una scarsa similarità di sequenza, l'FGF-b ha una struttura tridimensionale sorprendentemente simile a quella di FGF-a (che ha caratteristiche acide), a quella dell'interleuchina-1b (IL-1b) [46], una proteina proinfiammatoria che induce l'attivazione e proliferazione dei linfociti, e a quella dell'inibitore della tripsina da semi di soia [47]. Verrà valutata la possibilità che questi omologhi strutturali di FGF-b siano in grado di fungere da substrati o da inibitori dell'attività proteolitica della trombina.

STUDIO DELL'INTERAZIONE DELLA TROMBINA CON CON PEPTIDI DI beta-AMILOIDE. Studi recenti hanno dimostrato che livelli fisologici non tossici di peptidi beta-amiloidi (Ab), corrispondenti alla sequenza 1-40, 1-42 e 25-35, sono capaci di indurre una potente risposta angiogenica, probabilmente con un meccanismo che prevede l'interazione di Ab con l'FGF-b [25]. Come riportato in precedenza, la trombina e capace di proteolizzare l'FGF-b, disattivandolo. L'insieme di questi dati sembra, quindi, indicare che Ab e trombina possono funzionare come modulatori positivi e negativi, rispettivamente, delle funzioni dell'FGF-b in processi fisiologici e patologici.
I peptidi b-amiloidi 25-35, 1-40 e 1-42 verranno prodotti mediante sintesi chimica su fase solida e purificati all'omogeneità mediante RP-HPLC. Verrà verificata l'ipotesi che i peptidi amilodi possano interagire direttamente con FGF-b. Tale studio verrà condotto mediante cromatografia di gel-filtrazione analitica, mediante tecniche di spettrometria di massa in condizioni di pH fisiologico e mediante tecniche spettroscopiche (e.g., dicroismo circolare, fluorescenza).
Facendo uso delle stesse tecniche, verrà valutato l'eventuale binding di Ab alla trombina. Infine, verrà valutato l'effetto di Ab sulla capacità della trombina di idrolizzare l'FGF-b.

INTERAZIONE DELLA TROMBINA CON FATTORI DI CRESCITA VASCOLARI E NEURONALI: NGF, PDGF, BDNF e VEGF. Questi fattori di crescita stimolano in misura diversa la crescita ed il differenziamento di numerose linee cellulari: cellule endoteliali, fibroblasti, cellule muscolari lisce e cellule neuronali [14]. Queste piccole proteine mostrano una scarsa omologia di sequenza, ma possiedono una struttura molto simile: hanno un contenuto di struttura secondaria prevalente di tipo beta, sono caratterizzate da un appaiamento identico dei ponti disolfuro e di solito agiscono come dimeri, ma su recettori cellulari distinti. E' interessante notare che la produzione di tutti questi fattori di crescita è stimolata dalla trombina.
In questo Progetto ci si propone di studiare l'eventuale azione proteolitica della trombina su NGF, PDGF, BDNF e VEGF o la capacità di queste molecole di legarsi all'enzima e di modularne l'attività proteoliticainibire l'enzima. Queste proteine, isolate o in associazione, verranno incubate in condizioni fisiologiche con concentrazioni nanomolari di trombina. La generazione di eventuali frammenti proteolitici verrà valutata mediante spettrometria di massa, mentre l'eventuale formazione di complessi trombina-fattore di crescita sarà valutata con metodi spettroscopici (e.g., fluorescenza e dicroismo circolare). I risultati di questi studi saranno paragonati con quelli ottenuti dall'Unità di Ricerca di Roma (Prof. Landolfi) su opportune linee cellulari.

INTERAZIONE DI TROMBINA CON alfa-SINUCLEINA. L'alfa-sinucleina è una proteina acida di 140 amminoacidi. Essa è essenzialmente disordinata in soluzione [49], ma assume una conformazione parzialmente ad alfa-elica in presenza di vescicole fosfolipidiche [50]. Essa è particolarmente abbondante nei neuroni e nelle piastrine [37, 38]; è capace di penetrare nelle piastrine e costituisce il componente principale dei depositi proteici tipici del morbo di Parkinson [48]. L'alfa-sinucleina inibisce la degranulazione piastrinica [36], mentre la trombina induce tale processo, mediante attivazione del PAR-1 [21].
Verrà verificata l'ipotesi che la trombina (carica positivamente) possa interagire con (o proteolizzare)l'alfa-sinucleina (carica negativamente a pH fisiologico). I risultati di questi studi verranno comparati con quelli ottenuti dall'Unità di Ricerca di Roma su piastrine isolate ed incubate con alfa-sinucleina esogena, pre-trattata oppure no con in presenza o in assenza di trombina. I risultati di questi studi potranno avere importanti ricadute nella definizione dei meccanismi biochimici che presiedono all'insorgenza e progressione del morbo di Parkinson.

PROPRIETÀ AMILOIDOGENICHE INTRINSECHE DI TROMBINA E PROTROMBINA. In seguito a stimoli opportuni, la protrombina circolante viene trasformata in alfa-trombina attiva [51]. La trombina si accumula nel cervello di pazienti affetti dal morbo di Alzheimer [31] e ne è stata dimostrata l'esistenza sia nelle placche di beta-amiloide [52] che nei depositi che si riscontrano lungo i capillari cerebrali di pazienti affetti da morbo di Azheimer [53].
Recentemente, è stato dimostrato che l'alfa-chimotripsina, in presenza di trifluoroetalo (35% TFE) forma aggregati fibrillari di tipo amiloide [54]. La chimotripsina mostra elevata omologia di sequenza e strutturale con la trombina [40]. La solubilità della trombina è scarsa a pH fisiologico (50 microgrammi/ml) ed aumenta fino a pH 5; per valori inferiori, la trombina è praticamente insolubile [55].
In questo Progetto, ci si propone di studiare la propensità in vitro della alfa-trombina e della protrombina di formare strutture amiloidi, in condizioni sperimentali che favoriscano l'aggregazione proteica (e.g., bassi valori di pH e aggiunta di cosolventi organici) e che in qualche modo mimino il microintorno chimico in cui viene a trovarsi l'enzima in particolari condizioni fisiopatologiche. Infatti, come ampiamente riportato nella Base di Partenza Scientifica di questo Progetto, la trombina svolge un ruolo importante nel processo infiammatorio. Tale microambiente è di solito caratterizzato da un basso valore di pH. Ad esempio, sulla superficie dei macrofagi attivati, il pH è di circa 3.6 unità [56]. L'eventuale formazione di fibrille amiloidi verrà valutata con tecniche biochimiche (e.g., colorazione con Congo-red e con Tioflavina-T, resistenza alla proteolisi con proteinasi-K) e spettroscopiche (e.g., diminuzione della trasmittanza a 350 nm, dicroismo circolare, fluorescenza e FT-IR), già ben consolidate nello studio della fibrillogenesis [57-59] e disponibili nel nostro Laboratorio.