RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

NECESSITA' DI SORVEGLIANZA VIROLOGICA ED IMMUNOLOGICA NELLA POPOLAZIONE ITALIANA NELLA FASE FINALE DEL PROCESO DI ERADICAZIONE GLOBALE DELLA POLIOMIELITE

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - SCIENZE DI SANITA' PUBBLICA - ROMA(RM)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Gaetano Mario Luigi FARA

Descrizione

L'Italia è ormai un Paese polio-free, con certificazione ottenuta il 21 giugno 2002 insieme a tutti i Paesi della Regione Europea dell'OMS, dopo aver fornito i risultati di un complesso processo che ha visto intersecarsi attività di profilassi immunitaria ed attività di sorveglianza. In primo luogo la sorveglianza della paralisi flaccida acuta, ritenuta il gold standard delle attività necessarie per la certificazione ed, in ogni caso, strumento prezioso per far emergere i casi di paralisi vaccino-associata. Tale attività è stata accompagnata da attività supplementari, quali indagini sieroepidemiologiche per verificare lo stato immunitario della popolazione nei confronti della polio ed indagini virologiche per il controllo della circolazione ambientale di poliovirus (eventuali portatori sani e matrici ambientali). Una volta ottenuta la certificazione il Ministro della Salute ha approvato una bozza di piano di azione, redatto secondo le istruzioni dell'OMS, in cui vengono precisati obiettivi ed azioni per il mantenimento dello status di Paese libero da polio. In particolare, come obiettivo operativo, viene esplicitato il mantenimento di alte coperture vaccinali per prevenire la diffusione di poliovirus dopo un'eventuale importazione e la circolazione di poliovirus di derivazione vaccinale (VDPV). Infatti, nonostante il progressivo restringersi delle aree del mondo in cui persiste una circolazione endemica di poliovirus selvaggi, l'importazione di questi in territori indenni, e quindi anche in Italia, è sempre possibile, fino a che non si sarà giunti all'eradicazione globale della poliomielite. Inoltre, le epidemie provocate da VDPV hanno dimostrato quanto sia importante mantenere coperture sufficienti a livello di tutta la popolazione. Infatti tali epidemie sono state segnalate in Paesi in cui il controllo o l'eradicazione della polio sono stati realizzati grazie ad attività supplementari di vaccinazione (Giornate Nazionali e sub-Nazionali di Immunizzazione – NIDs e sub-NIDs), piuttosto che grazie a vaccinazioni routinarie e continuative nel tempo; in tal modo è possibile ottenere un'alta copertura immunitaria nei bambini di età 0-5 anni, fascia di popolazione destinataria dell'intervento di immunizzazione, mentre le coperture nella rimanente parte della popolazione sono insufficienti e distribuite in maniera disomogenea sul territorio.
In situazioni simili, con una copertura a macchia di leopardo, i virus vaccinali possono circolare anche per lunghi periodi in modo silenzioso, riacquisendo caratteristiche di neurovirulenza e di trasmissibilità molto simili a quelle dei virus selvaggi (omologia rispetto ai ceppi parentali vaccinali inferiore al 99%) e provocare improvvisamente focolai epidemici. Dal punto di vista clinico ed epidemiologico, pertanto, i VDPV sono da considerare alla stessa stregua dei poliovirus selvaggi.
Dagli studi più recenti effettuati in Italia, a livello nazionale, è emerso che vi è, sia tra i bambini sani che nell'ambiente, un'ampia circolazione di poliovirus tutti Sabin like. Tuttavia è da sottolineare che sono stati riscontrati poliovirus vaccinali in bambini di età anche molto diversa da quella in cui è prevista la vaccinazione. Ciò avvalora l'ipotesi di una circolazione di virus vaccino-derivati che, in mancanza di sintomatologia clinica, vengono facilmente trasmessi da persona a persona ed essendo eliminati con le feci raggiungono, insieme con i liquami, soprattutto se non trattati, diverse matrici ambientali che a loro volta facilitano la circolazione degli stessi. Inoltre è necessario sottolineare che la stragrande maggioranza dei ceppi virali Sabin like isolati erano retromutati verso la neurovirulenza. In particolare, il 44% dei poliovirus tipo 1 mostrava retromutazione verso la neurovirulenza alla posizione 480 (G versus A); il 100% dei poliovirus tipo 2 mostrava retromutazione alla posizione 481 (A versus G) e il 96% dei poliovirus tipo 3 era mutato a livello della posizione 472 (U versus C). Per quel che riguarda l'isolamento di virus vaccinoderivati da matrici ambientali, i poliovirus tipo 2 e 3 mostravano preferibilmente retromutazione come descritto.
I dati della sorveglianza sulla circolazione dei poliovirus OPV-derivati, insieme ai dati epidemiologici sulla sorveglianza della paralisi flaccida, hanno comunque mostrato l'assenza di poliovirus selvaggio e di conseguenza portato al cambiamento della schedula vaccinale, in un primo momento con la schedula sequenziale IPV-OPV, poi, a partire dal luglio 2002, con solo IPV. Da circa due anni, quindi, nel nostro Paese non vengono somministrate dosi di vaccino vivo attenuato. Il Ministero della Salute si è impegnato a conservare dosi di OPV da utilizzare esclusivamente nelle emergenze. Il dato positivo di questo cambiamento consiste nella eliminazione dei casi di paralisi flaccida associati a vaccino. Il dato su cui riflettere invece è il progressivo accumulo di soggetti privi di immunità mucosale (IPV conferisce solo un'immunità umorale), i quali potrebbero infettarsi e, senza ammalare, consentire la replicazione a livello intestinale, e quindi eliminare virus che, circolando, potrebbero accumulare mutazioni con il risultato di stipiti virali biologicamente differenti dai ceppi parentali. Nell'ultima sorveglianza virologica, effettuata nel 2000-01 in bambini di età 0-14 anni, è stata messa in evidenza la presenza di portatori di poliovirus in età anche molto distante da quella vaccinale. Il fenomeno era trasversale in tutte le regioni.
Bisogna ancora sottolineare che l'Italia è un crocevia mondiale, nel nostro paese ogni giorno confluisce gente da tutto il globo; nel nostro paese arrivano anche immigrati da paesi dove la polio è ancora endemica, da paesi che hanno recentemente importato poliovirus selvaggio dalla Nigeria e da paesi che utilizzano OPV come unico vaccino. Il rischio di importazione del virus selvaggio esiste, come dimostrato anche dai recentissimi casi in Arabia Saudita, mentre il pericolo di importazione di OPV e VDPV sembra molto consistente. In linea con i suggerimenti dell'OMS sembra a questo riguardo importante valutare se ancora, ed eventualmente con quali modificazioni genetiche, i virus vaccinali ed i virus derivati dagli stipiti vaccinali continuano a circolare nell'ambito della nostra popolazione.
Allo scopo le indagini possibili riguardano il controllo dei portatori ed il controllo ambientale vero e proprio.
Il presente progetto riguarda la sorveglianza di poliovirus, dal selvaggio ai virus sabin-like e vaccino-derivati in matrici ambientali ed in portatori sani reclutati nella fascia di età 0-14 anni dopo 2 anni dall'introduzione della schedula vaccinale tutto IPV ed in coincidenza con l'introduzione del nuovo calendario vaccinale previsto dal Piano vaccini approvato dalla Conferenza Stato-Regioni, piano che prevede di spostare al 6° anno la dose di richiamo. Per valutare, inoltre, quale effetto ha avuto nel tempo l'introduzione del full IPV (assenza di dosi booster legate alla circolazione dei Sabin derivanti dalla vaccinazione OPV) e quindi su quale situazione immunitaria si inserisce la nuova modifica, il presente progetto prevede di esaminare l'effettiva copertura immunitaria in soggetti di 0-14 anni.
La qualificazione dell'Unità 001 (Roma) per il presente progetto è testimoniata dal ruolo svolto in qualità di referente per la regione Lazio nella rete nazionale di sorveglianza della Paralisi Flaccida Acuta e per essere stata identificata come Laboratorio Virologico Sub-Nazionale di riferimento OMS/WHO.

Dato che il presente progetto è di fatto una sorveglianza virologica e immunologica di Sanità pubblica, che dovrà essere confrontata anche con situazioni esterne al nostro Paese, le metodiche indicate sono quelle ufficialmente riconosciute dall'OMS.

Obiettivo 1:
sorveglianza della circolazione di poliovirus, selvaggio, virus sabin-like e vaccino derivati (VDPV) in matrici ambientali
Campioni di liquami - Metodo – 2 campioni di liquami/mese saranno raccolti per 18 mesi consecutivi, all'ingresso di 2 depuratori nei capiluogo di provincia della regione Lazio; nell'ambito di Roma saranno esaminati, con la stessa cadenza, 4 depuratori.

Volume trattato 1 litro
I virus eventualmente presenti saranno concentrati, separatamente per il sedimento e la fase acquosa, con metodiche di ultrafiltrazione molecolare a flusso tangenziale utilizzando membrane in polisulfone (prep-Scale - 10.000 NMWL- Millipore). Per evitare intasamento delle membrane la fase acquosa sarà sottoposta a prefiltrazione. Il filtro verrà fluito con estratto di carne pH 9.
I concentrati, dopo neutralizzazione del pH, verranno decontaminati con estrazione in cloroformio e conservati a -80° fino all'inoculo in colture cellulari.

Campioni di acqua del fiume Tevere: 2 volte al mese, per 18 mesi, verrà prelevato un campione all'altezza di ponte della Scafa, tratto terminale del Tevere, fiume che soprattutto nell'area di Roma riceve l'apporto di corsi d'acqua inquinati e di liquami trattati e non.
Volume trattato 10 litri.
La metodica è sostanzialmente identica alla precedente, fatta eccezione per la raccolta separata del sedimento.

Isolamento virale
I concentrati saranno inoculati in cellule BGM, L20B. le colture saranno mantenute per 15 giorni e verranno effettuati almeno 2 passaggi, più un terzo di conferma per i positivi. Gli isolati su cellule BGM verranno ripassati su L20B.

Identificazione dei virus isolati
Su tutti gli isolati è prevista l'esecuzione della PCR per discriminare tra enterovirus e virus enterici non enterovirus utilizzando primer individuati nella regione 5' non codificante. I lisati cellulari delle colture presentanti effetto citopatico, riferibili ad enterovirus, saranno sottoposti a identificazione utilizzando il test di neutralizzazione dell'effetto citopatico mediante antisieri specifici forniti dal National Institute of Public Health and Environment (RIVM), Bilthoven - Olanda. La differenziazione intratipica degli eventuali poliovirus isolati sarà effettuata mediante PCR in modo da distinguere tra ceppi Sabin like o non Sabin like, utilizzando specifici primer (CDC) e con un sistema ELISA (RIVM). Il sequenziamento della regione codificante per la VP1/2A verrà eseguita con PCR. Verrà verificata la presenza di retromutazioni sequenziando la regione 5' NCR dei poliovirus Sabin-like eventualmente isolati.

Obiettivo 2: sorveglianza della circolazione di poliovirus, selvaggio, virus sabin-like e vaccino derivati derivati (VDPV) in campioni di feci di bambini di età 0-14 anni.

Campionamento: si prevede di esaminatre l'1°/°° dei bambini residenti di età 0-14 anni, pari a 748 soggetti. I campioni saranno distribuiti in modo omogeneo nelle classi di età 0-4, 5-9, 10-14 e sul territorio regionale.
La ricerca sarà effettuata mediante semina dell'estratto fecale su tre linee cellulari, Hep-2, RD e L20B. Le cellule L20B sono cellule di topo modificate in modo da essere suscettibili ai poliovirus. Sono pertanto più selettive delle altre linee cellulari, che invece sono suscettibili anche agli altri enterovirus, oltre che a virus enterici non enterovirus, come ad esempio gli adenovirus. Per questo motivo tutti gli isolati su cellule RD ed Hep-2 verranno ripassati su cellule L20B in modo da selezionare, tra i ceppi virali isolati, quelli da identificare con la neutralizzazione dell'effetto citopatico. Su tutti gli isolati è comunque prevista l'esecuzione della PCR per discriminare tra enterovirus e virus enterici non enterovirus utilizzando primers individuati nella regione 5' non codificante. La neutralizzazione dell'effetto citopatico sarà effettuata mediante antisieri specifici forniti dal National Institute of Public Health and Environment (RIUM), Bilthoven - Olanda. La differenziazione intratipica degli eventuali poliovirus isolati sarà effettuata mediante PCR in modo da distinguere tra ceppi Sabin like o non Sabin Like utilizzando specifici primers (CDC) e con un sistema ELISA (RIUM). Il sequenziamento della regione codificante per la VP1/2A verrà eseguita con PCR. Verrà verificata la presenza di retromutazioni sequenziando la regione 5' NCR dei poliovirus Sabin-like eventualmente isolati.

Obiettivo 3: sorveglianza della protezione immunitaria in bambini di 0-14 anni
Campionamento: si prevede di esaminare l'1°/°° dei bambini residenti di età 0-14 anni, pari a 748 soggetti. I campioni saranno distribuiti in modo omogeneo nelle classi di età 0-4, 5-9, 10-14 e sul territorio regionale
La determinazione del titolo anticorpale sarà effettuata con la neutralizzazione dell'effetto citopatico (Linee guida OMS)

Risultati attesi:
Sorveglianza virologica: Dato che in Italia non ci sono casi autoctoni di poliomielite ci si attende di non trovare il poliovirus selvaggio. E' invece probabile isolare ancora poliovirus vaccinali, anche se ci si attende una minore frequenza di isolamenti rispetto al passato. Dopo l'analisi dei risultati potranno essere valutate le strategie attuali di sorveglianza. In particolare andrebbero potenziate tutte le attività di sorveglianza e gli studi sulla relazione tra eliminazione protratta di virus ed immunodeficienza
Sorveglianza sierologica: Se saranno riscontrati titoli anticorpali elevati nei bambini piccoli sottoposti a vaccinazione IPV (esavalente) questo dato garantirà che lo spostamento della dose di richiamo dal 3° al 5-6° anno di età è realizzabile senza creare problemi. I livelli anticorpali dei bambini più grandi serviranno a verificare se l'assenza di booster causata dall'eliminazione di OPV provochi o meno uno spostamento dei titoli stessi verso valori non protettivi