RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

NECESSITA' DI SORVEGLIANZA VIROLOGICA ED IMMUNOLOGICA NELLA POPOLAZIONE ITALIANA NELLA FASE FINALE DEL PROCESO DI ERADICAZIONE GLOBALE DELLA POLIOMIELITE

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - Virologia - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Maria BARBI

Descrizione

L'assenza di circolazione dei poliovirus selvaggi in Italia è stata certificata, come negli altri Paesi della Regione Europea dell'OMS, il 21 giugno 2002 (1). Lo stato di Paese polio-free è stato raggiunto grazie alla istituzione, a partire dal 1966, della vaccinazione obbligatoria per tutti i nuovi nati con l'impiego del vaccino di Sabin. Questo ha portato alla rapida caduta dell'incidenza della malattia e alla registrazione degli ultimi casi autoctoni nel 1982. A partire dal 1996, in ottemperanza alle raccomandazioni dell'OMS, è stata istituita la rete per la sorveglianza attiva della paralisi flaccida acuta con il compito di individuare con tempestività e accuratezza l'eventuale verificarsi di casi di malattia e di isolarne e caratterizzarne i ceppi virali responsabili (2, 3). Né questa attività né attività complementari quali indagini virologiche per il controllo della circolazione virale in portatori sani o nell'ambiente hanno mai indicato la presenza di virus selvaggi. Quest'ultimo tipo di indagini, condotto a più riprese a livello regionale o nazionale, ha invece evidenziato la presenza di ceppi virali di derivazione vaccinale e retromutati (4, 5). In particolare in uno studio nazionale svolto nel 2000 (6) virus Sabin-like sono stati ritrovati in 93 dei 5714 (1.6%) campioni di feci di bambini sani. Nell'ambito dello stesso studio i campioni raccolti in Lombardia risultati positivi per poliovirus sono stati 23 su 1363 (1.7%) e in una considerevole proporzione (1.9%, 7/360) in soggetti appartenenti alla fascia di età 10-15 anni in cui in Italia non è prevista la vaccinazione (7). Il dato indicava l'esistenza di una notevole circolazione di virus di derivazione vaccinale in particolare se si considera che dal 1999 la schedula vaccinale italiana era stata modificata con il passaggio alla modalità mista costituita da 2 dosi di vaccino inattivato (IPV) seguite da 2 dosi di OPV e che, pertanto, doveva risultare ridotta la quota di soggetti in grado di eliminare virus vaccinale in conseguenza dell'assunzione del vaccino.
La nuova modifica della schedula vaccinale, attuata nel 2002, con il passaggio alla vaccinazione con solo IPV ha fatto sì che da circa 3 anni non vengano somministrate nel nostro Paese dosi di vaccino attenuato. Questo comporta che non essendoci più immissioni di virus poliomielitici vaccinali nella popolazione e nell'ambiente la circolazione virale dovrebbe essere cessata. Peraltro conseguenza della vaccinazione con IPV è il progressivo accumulo di soggetti privi di una efficiente immunità mucosale i quali potrebbero infettarsi e, senza ammalare, consentire la replicazione a livello intestinale e quindi eliminare virus che, circolando potrebbero accumulare mutazioni con il risultato di determinare la comparsa di stipiti virali biologicamente differenti dai ceppi attenuati parentali.
La rapida identificazione della presenza nella popolazione di poliovirus selvaggi o di VDPV e la sua segnalazione tempestiva possono essere determinanti nel limitare la circolazione di tali stipiti. In considerazione del rischio rappresentato da una fortuita introduzione di ceppi selvaggi nella popolazione a seguito della massiccia ondata migratoria in ingresso nel nostro Paese e del potenziale patogeno dei VDPV la verifica della possibilità e dell'accuratezza di una diagnosi rapida potranno inquadrare tale tipo di accertamento nelle strategie da adottare nella fase post-certificazione a livello nazionale e internazionale.

Obiettivi - Il presente progetto di ricerca si propone di: a) verificare l'assenza di poliovirus selvaggi; b) accertare se la modifica della schedula vaccinale antipoliomielitica che ha portato alla completa sostituzione del vaccino di Sabin con quello a virus inattivati di Salk abbia determinato la scomparsa della circolazione dei virus derivaivti da vaccino; c) caratterizzare gli stipiti di poliovirus eventualmente isolati da estratti fecali e da campioni di liquame confrontandone le caratteristiche genomiche con quelle dei virus di Sabin e dei ceppi evidenziati nelle indagini precedenti; d) valutare l'applicabilità della ricerca dell'RNA virale mediante RT-PCR nell'identificare rapidamente la presenza di poliovirus nella popolazione esaminata.; d) correlare i dati ottenuti con la valutazione sia della copertura vaccinale sia della prevalenza dell'immunità antipoliomielitica nella popolazione studiata.
La qualificazione dell'Unità Milano del presente progetto di ricerca è testimoniata dal ruolo svolto in qualità di: a) referente per la Lombardia della rete nazionale di sorveglianza della Paralisi Flaccida Acuta (PFA); b) laboratorio virologico sub-nazionale di riferimento OMS.

Disegno - La circolazione dei virus poliomielitici nella popolazione lombarda verrà accertata mediante l'analisi con prove di isolamento in coltura cellulare di campioni di feci di soggetti sani di età inferiore ai 15 anni e di campioni di liquami affluenti ai depuratori. La possibilità di pervenire ad una rapida evidenziazione della presenza di poliovirus tramite la ricerca dell'acido nucleico virale mediante RT-PCR sarà verificata confrontando i risultati di tali test con quelli ottenuti nelle prove di isolamento.. La sieroprevalenza antipoliomielitica verrà determinata con la titolazione degli anticorpi neutralizzanti antipoliomielitici in bambini di età inferiore ai 15 anni.

Materiali e metodi - Saranno esaminati i campioni di feci di circa 1200 soggetti sani di età compresa tra 0 e 14 anni residenti in Lombardia raccolti con la collaborazione dei Dipartimenti di Prevenzione delle ASL lombarde,. Ciascun campione sarà accompagnato da una scheda in cui verranno registrati età, sesso e storia vaccinale del soggetto prelevato. Saranno anche esaminati campioni di liquame in entrata ai depuratori di alcune città lombarde, raccolti nell'arco di 18 mesi con cadenza bimensile.
a)Feci – isolamento - Per le prove di isolamento i campioni di feci verranno trattati secondo le metodiche standardizzate raccomandate dall'OMS (8). Gli estratti saranno inoculati in cellule HEp-2 RD ed L20B ed esaminati giornalmente, per un tempo complessivo di almeno 15 giorni, per la comparsa di effetto citopatico. Verranno considerati negativi i campioni con assenza di alterazioni del monostrato dopo almeno un passaggio in cieco.. I lisati cellulari delle colture con effetto citopatico saranno sottoposti a identificazione utilizzando il test di neutralizzazione in coltura cellulare mediante antisieri specifici anti poliovirus ed enterovirus (RIVM, Bilthoven, Olanda).
b) Feci – RT-PCR - L'estrazione dell'RNA virale dai campioni di feci verrà eseguita con il trattamento con fenolo e cloroformio seguito da precipitazione in etanolo. Dopo retrotrascrizione dei primi 600 nucleotidi della regione 5' non codificante, il cDNA ottenuto verrà amplificato mediante nested-PCR impiegando 2 coppie di primer individuati all'interno della sequenza altamente conservata tra gli enterovirus (10). In caso di positività si procederà immediatamente ad una successiva RT-PCR utilizzando primer specifici per poliovirus (nt 1189 – 1210) (11). Complessivamente il risultato dell'indagine sarà disponibile in un tempo minimo di 3 giorni dal ricevimento del campione.
c) Liquami- isolamento - I campioni di liquame saranno trattati e concentrati mediante il metodo di separazione in due fasi indicato dall'OMS (9) e successivamente inoculati in cellule BGM e L20B che verranno osservati con le stesse modalità indicate per le feci. Periodicamente si procederà alla verifica della qualità del metodo attraverso la conduzione di esperimenti di infezione artificiale di aliquote di campioni in esame con sospensioni di poliovirus a concentrazione nota, volti ad assicurare che il metodo sia in grado di rilevare la presenza di 10-20 TCDI50 in 500ml di liquame (9)
d) Sieroprevalenza - La sieroprevalenza antipoliomielitica verrà determinata con la titolazione degli anticorpi neutralizzanti antipoliomielitici nel siero di circa 1200 bambini entro i 14 anni, 400 circa per classe di età (0-4, 5-9, 10-14) residenti nella Regione Lombardia. Saranno considerati protettivi i titoli maggiori o uguali a 1:8. I risultati saranno espressi come frequenza di positività per uno o più virus e come media geometrica dei titoli e saranno analizzati per età e stato vaccinale
e) Caratterizzazione genomica – I ceppi di poliovirus eventualmente rinvenuti verranno inviati all'Unità Operativa di Roma per la differenziazione intratipica e il sequenziamento.
f) Controlli di qualità – I controlli di qualità verranno svolti tramite l'esame di idonei pannelli di campioni predisposti dall'Unità Operativa Roma per quanto riguarda la ricerca di poliovirus nelle feci tramite RT-PCR e la titolazione degli anticorpi neutralizzanti. Per i liquami il confronto tra estrazione in due fasi ed estrazione mediante ultrafiltrazione verrà svolta esaminando in parallelo a Milano e a Roma campioni lombardi di liquame.

Bibliografia
1. Euro Surveill. The WHO European Region declared free of polio. 2002 May;7(5):76-7
2. Fiore L, Novello F, Simeoni P, Amato C, Vellucci L, De Stefano D, Grandolfo ME. Luzzi I, and the AFP Study Group (…..Barbi M, ….). Surveillance of acute flaccid paralysis in Italy: 1996-1997. Eur J Epid 1999; 15:757-763.
3. Fiore L, Novello F, Simeoni P, Amato C, Buttinelli G, Fiore S, Vellucci L, De Stefano D, Grandolfo ME, Luzzi I ed il gruppo di Studio delle AFP (….Barbi M, ….). Epidemiologia delle paralisi flaccide acute in Italia. Ann Ig 2000; 12: 99-110
4. Patti AM, Santi AL, Fiore L et al. Enterovirus surveillance of Italian healthy children. Eur J Epidemiol 2000; 16: 1035-8.
5. Patti AM, Santi AL, Fiore L et al.. Environmental surveillance of poliovirus in Italy: pilot study. Ann Ig 2003; 15: 97-105.
6. Patti AM, Santi AL, Vulcano A et al. Surveillance of poliomyelitis in Italy: Immunità status of population against polio andenvironmental circulation of poliovirus. General illustration of the results. Ann Ig 2002; 14 (Suppl 5): 1-57.
7. Barbi M, Didò P, Binda S, Caroppo S. Surveillance of poliomyelitis in Italy: Immunity status of population against polio and environmental circulation of poliovirus. Lombardia. Ann Ig 2002; 14 (Suppl 5):18-20.
8. WHO/EPI/GEN/97.01
9. WHO. Guidelines for environmental surveillance of poliovirus circulation. WHO/V&B/03.03
10. Severini GM, Mestroni L, Falaschi A, Camerini F, Giacca M. Nested polymerase chain reaction for high-sensitivity detection of enteroviral RNA in biological samples. J Clin Microbiol 1993; 31:1345-1349.
11. Pregliasco F, Mensi C, Beltramelli G, Olati M. Ricerca di Enterovirus in acque superficiali mediante RT-PCR: esperienze sul fiume Ticino. Ann Ig 1999; 11: 43-55.