RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

NECESSITA' DI SORVEGLIANZA VIROLOGICA ED IMMUNOLOGICA NELLA POPOLAZIONE ITALIANA NELLA FASE FINALE DEL PROCESO DI ERADICAZIONE GLOBALE DELLA POLIOMIELITE

Università di riferimento

Università degli Studi di PARMA - SANITA' PUBBLICA - PARMA(PR)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Maria Luisa TANZI

Descrizione

Trattandosi di uno studio multicentrico, nella prima fase, in accordo con le UU.OO. di Roma, Milano e Bari sarà discusso e messo a punto il protocollo di indagine.
Il progetto prevede due fasi: la prima di 21 mesi per la pianificazione del lavoro, il campionamento e lo svolgimento delle analisi; la seconda di 3 mesi per l'elaborazione dei dati e la presentazione dei risultati.

MATERIALI E METODI
A) Ricerca di enterovirus ed in particolare poliovirus in campioni di feci di:
- n. 459 soggetti sani di eta' compresa tra 0-14 anni , di nazionalità italiana o immigrati, provenienti da scuole materne, elementari e medie della città di Parma;
- n. 50 bambini circa, recentemente immigrati, oggetto di adozione internazionale visitati presso il Centro Adozioni internazionali di Parma.
B) Valutazione dello stato immunitario antipoliomielitico di:
- n. 459 soggetti sani di eta' compresa tra 0-14 anni;
- bambini oggetto di adozione internazionale giunti al Centro di riferimento di Parma.
C) Ricerca di poliovirus nell'ambiente.

A)INDAGINE VIROLOGICA
L'indagine virologica (campionamento, isolamento, caratterizzazione) verrà condotta secondo metodiche standardizzate raccomandate dal WHO (13).Tutti i campioni fecali saranno sottoposti a trattamento di decontaminazione con cloroformio, per rimuovere batteri, funghi e lipidi citotossici. I campioni saranno trattati entro poche ore dalla raccolta e gli estratti fecali conservati a -20°C fino alla loro semina su colture di tessuto.
Ciò prevede l'impiego di 3 linee cellulari: Hep2, RD e L20B. L'uso di L20B (linea cellulare di topo geneticamente modificata per esprimere i recettori umani per il poliovirus) è raccomandata dal WHO in quanto altamente selettiva per la crescita di virus poliomielitici. Ogni campione sarà inoculato in doppio (almeno 2 passaggi) sulle linee cellulari suddette; per non perdere alcun poliovirus tutte le colture positive in RD e Hep-2 ma negative in L20B saranno ripassate in tale linea cellulare in quanto è noto che una piccola percentuale di poliovirus isolati possono non dare effetto citopatico al primo passaggio in L20B(14).
La caratterizzazione degli isolati avverrà con reazione di neutralizzazione dell'infettività mediante impiego di pools di sieri standard per enterovirus e monovalenti per i tre tipi di virus polio (RIVM, Bilthoven, Olanda).
Si procederà preliminarmente all'estrazione dell'RNA virale dalle feci con successiva amplificazione genica, così da attuare uno screening rapido che consenta di risalire velocemente, in base alla provenienza geografica del campione, alla possibile area di circolazione dei virus identificati.
Per l'estrazione dell'RNA virale dai campioni di feci, verranno impiegati fenolo e cloroformio seguiti da precipitazione etanolica. Seguirà quindi la fase di retrotrascrizione ed amplificazione mediante nested-PCR, utilizzando due coppie di primers relativi alla regione 5' non codificante e specifici per l'identificazione di enterovirus. In caso di positività verrà effettuata una ulteriore amplificazione con primers specifici per poliovirus(15,16).
Inoltre tutti gli enterovirus isolati da colture cellulari saranno anche esaminati con le stesse metodiche di biologia molecolare (RT-PCR) sopra descritte.
I poliovirus eventualmente isolati, verranno inviati all'Unità operativa di Roma per la caratterizzazione genetica.

B) INDAGINE SIEROLOGICA
Saranno testati i sieri di almeno 459 soggetti sani tra 0-14 anni, circa 155 per classi di età (0-4; 5-9; 10-14 anni) residenti in Emilia Romagna. Su questi campioni verrà determinata la sieroprevalenza nei confronti dei tre virus poliomielitici mediante titolazione degli anticorpi neutralizzanti l'infettività in colture di tessuto. Il titolo anticorpale sarà desunto dalla più alta diluizione di siero in grado di proteggere completamente le culture cellulari contro 100 TCID50 di virus challenge. Titoli anticorpali uguali o superiori a 1:8 saranno considerati protettivi.
I risultati saranno stratificati per età, stato vaccinale (dove sia possibile risalire alla scheda vaccinale), immunocompetenza, area geografica di provenienza.
Saranno inoltre sottoposti ad indagine sierologica campioni di sangue raccolti da ciascun bambino controllato presso il Centro per le Adozioni internazionali di Parma.

C) INDAGINE AMBIENTALE
Per verificare l'eventuale presenza di virus poliomielitici nell'ambiente verranno esaminati campioni di liquame in ingresso ai 2 depuratori della città di Parma. I 2 depuratori possiedono una potenzialità di 150.000 abitanti. Il monitoraggio prevede la raccolta di 2 campioni di liquame al mese (campione medio delle 24 ore) che saranno analizzati presso la nostra unità operativa secondo una metodica suggerita dal WHO (Guidelines for environmental surveillance of poliovirus circulation)(17), e per confronto, alcuni campioni saranno inviati all'Unità Operativa di Roma, dove verranno analizzati secondo la metodica di riferimento a flusso tangenziale. La ricerca di virus enterici avverrà mediante la semina dell'estratto ottenuto dalla concentrazione del liquame (metodica WHO)in 2 linee cellulari: BGM ed L20B. Periodicamente verranno praticati esperimenti di infezione artificiale con sospensione di poliovirus a concentrazione nota per verificare l'efficienza del metodo che risulta in grado di rilevare la presenza di 10-20 TCID50 in 500 ml di liquame.
I poliovirus eventualmente isolati, verranno inviati all'Unità Operativa di Roma per la caratterizzazione genetica.