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UNITA' DI RICERCA
italiano - english
Bibliografia
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Programma di ricerca
Bronchiectasie nel paziente con BPCO: prevalenza e colonizzazione batterica.Università di riferimento
Università degli Studi di MILANO - Tisiologia e malattie dell'apparato respiratorio - MILANO(MI)Responsabile dell'Unità di ricerca
Francesco BLASIDescrizione
La UO 1 si occuperà dell'arruolamento di circa 100 pazienti con BPCO e dello studio dei markers infiammatori su sangue e esalato bronchiale dell'intera casistica arruolata nel protocollo di studio. Inoltre, su tutta la casistica arruolata, verranno eseguite metodiche di biologia molecolare, PCR e real-time PCR, per la identificazione di batteri nell'espettorato o broncoaspirato. Inoltre si effettueranno colture in microbiologia standard dei campioni di espettorato/broncoaspirato ottenuti dai pazienti arruolati dalla UO 1.In collaborazione con la UO di radiologia afferente a IRCCS Fondazione Policlinico-Mangiagalli-Regina Elena di Milano verranno eseguite le TC multislice previste dal protocollo e le registrazioni su CD rom verranno inviate alla UO 4 (Zompatori) per l'analisi dell'immagine.
Nel secondo anno del protocollo verranno seguiti i pazienti con bronchiectasie randomizzati come indicato dal protocollo di studio.
Le seguenti metodiche sono attive presso la UO 1 e verranno utilizzate per il presente protocollo:
- Condensato dell'esalato bronchiale (EBC)
I campioni di condensato di esalato bronchiale sono raccolti utilizzando una camera di condensazione apposita (Ecoscreen; Jaeger, Hoechberg, Germany); l'aria esalata entra e esce dalla camera attraverso valvole ad una via di ingresso e uscita mantenendo pertanto la camera chiusa. Il soggetto ha una clip nasale e respira a volume corrente attraverso un boccaglio connesso alla camera di condensazione per 10 minuti. Aliquote di 1 ml di campione vengono raccolte in provette di plastica da 2 ml, che vengono conservate a –70°C.
-Test per citochine su siero e EBC
Tutti i campioni di EBC vengono controllati per contaminazione salivare con una elettroforesi bidimensionale.
Le concentrazioni di IL-6, IL-8, TNF-a e leucotrieni nel siero e nel EBC vengono misurate con tests specifici in enzyme immunoassay (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, USA). Il test viene validato con gas cromatografia e spettrofotometria di massa.
Il limite di rilevamento per le citochine è 1.5 pg/ml dopo un periodo di sviluppo della reazione di due ore. La riproducibilità viene controllata con il metodo di Bland and Altman e con il coeficiente di variazione.
-Analisi proteinomica
L'analisi proteinomica verrà effettuata solo sui pazienti arruolati presso la UO 1. La metodica è già in uso presso la UO in collaborazione con il Dipartimento di Farmacologia dell'Università degli Studi di Milano. Sul campione di EBC vengono effettuate elettroforesi mono e bidimensionale e per l'analisi qualitative un'analisi in spettrofotometria di massa. Il gel viene impregnato con nitrato d'argento, con o senza glutaraldeide nello step di sensibilizzazione e con formaldeide nella soluzione di impregnazione. I volumi degli spot vengono calcolati utilizzando Image J 1.29x (W. Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) per i gel monodimensionali e con PDQUEST (Biorad, Hercules, California) per i gel bidimensionali.
-Biologia molecolare su espettorato/broncoaspirato/BAL
Sui campioni ottenuti dai pazienti arruolati dalla UO e da quelli dei pazienti arruolati dalle altre UO partecipanti al protocollo di studio verrà effettuata una ricerca per il DNA batterico di Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae. Si utilizzeranno metodiche di PCR (qualitativa) e di RT-PCR (quantitativa) secondo protocolli standard.
Campioni di cellule mononucleate periferiche verranno stoccate per l'analisi in Elispot presso la UO 2.
In collaborazione con la UO 3 valuteremo biopsie bronchiali di soggetti BPCo e BPCO con bronchiectasie utilizzando una metodica di microscopia elettronica a scansione
