RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MALATTIE, AMBIENTE E SOCIETA' ALLA CORTE GRANDUCALE DI FIRENZE: STUDIO STORICO, ARCHEOLOGICO E PALEOPATOLOGICO DELLE DEPOSIZIONI FUNEBRI DEI MEDICI (SECOLI XVI-XVIII)

Università di riferimento

Università degli Studi di CAMERINO - BIOLOGIA MOLECOLARE, CELLULARE E ANIMALE - CAMERINO(MC)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Franco Ugo ROLLO

Descrizione

Diagnostica molecolare delle malattie infettive

Con questo progetto di ricerca ci si prefigge di eseguire uno screening molecolare dei resti scheletrici di membri della famiglia Medici risalenti ai secoli XVI-XVIII ed inumati presso le Cappelle Medicee a Firenze. Le testimonianze scritte suggeriscono che diversi personaggi della dinastia sarebbero morti per cause riconducibili a malattie infettive quali tubercolosi, sifilide, peste e vaiolo. I casi storicamente più attendibili sono elencati sotto.
Tubercolosi (Eleonora di Toledo, 1522-1562; Anna ,1569-1584; Don Filippo, 1577-1582; Cosimo II, 1590-1621).
Sifilide (Ferdinando, 1663-1713).
Peste (Francesco, 1614-1634).
Vaiolo (Ferdinando II, 1610-1670; Principe Mattia, 1613-1667; Cardinale Leopoldo, 1617-1675; Cosimo III, 1642-1723; Gian Gastone, 1671-1737).
Come premesso (Base di partenza scientifica nazionale o internazionale), l'analisi del paleo-DNA potrà, pertanto, avere finalità diverse: 1) confermare le diagnosi paleopatologiche formulate attraverso l'esame macro- e microscopico dei resti; 2) risolvere casi controversi; 3) mettere in evidenza patologie infettive in assenza di riscontri anatomici o istologici.
Lo screening verrà eseguito presso questa unità di ricerca a partire da campioni bioptici che verranno raccolti operando congiuntamente all'unità di ricerca dell'Università di Pisa (prof. G. Fornaciari).
Per l'identificazione del DNA dei patogeni si procederà all'estrazione del DNA dai campioni (frammenti di tessuto molle essiccato, carote di osso o denti) operando in un locale appositamente attrezzato per minimizzare il rischio di contaminazioni ("camera DNA free") di cui è provvisto il nostro laboratorio.
Verranno utilizzate procedure codificate per l'estrazione del DNA da materiali archeologici (Marota and Rollo, 2002; Cooper and Poinar, 2000). Il DNA verrà successivamente purificato per rimuovere eventuali inibitori e quindi amplificato mediante sistemi di reazione a catena della polimerasi (PCR) specifici per i diversi microrganismi oggetto di indagine. L'analisi del DNA sarà preceduta dall'esame dello stato di diagenesi molecolare del materiale. Questo test è basato sull'esame del grado di racemizzazione dell'acido aspartico. E' stato dimostrato che rapporti tra forma D e forma L (D/L asp) superiori a 0.080-0.1 sono incompatibili con la conservazione del DNA originale (Poinar et al., 1996). Valori inferiori sono invece indicativi della sua preservazione (Rollo et al., 2002; Marota et al., 2002).
Per quanto riguarda i sistemi di PCR da utilizzare per la ricerca del DNA dei patogeni verranno utilizzati, a seconda delle circostanze, sistemi specifici o sistemi cosiddetti "universali". In particolare, per quanto riguarda la ricerca del DNA di M. tuberculosis verrà utilizzato un sistema di PCR progettato in base alla sequenza nucleotidica dell'elemento IS6110. Si tratta del marcatore biologico ideale per le diagnosi paleomolecolari, in quanto è presente in numerose copie sul cromosoma batterico. Il sistema di PCR basato sulla sequenza IS6110 ha permesso di ottenere importanti risultati circa la diffusione di M. tuberculosis nelle popolazioni dei secoli passati (Dixon and Roberts, 2001).
La ricerca del DNA di Treponema pallidum verrà eseguita applicando la procedura di Kolman et al. (1999).
La ricerca del DNA di Yersinia pestis verrà condotta utilizzando le procedure messe a punto da Drancourt et al. (1998) e da Raoult et al. (2000). Si tratta, fondamentalmente, di sistemi di PCR diretti al gene rpoB (il gene che codifica per la subunità beta della RNA polimerasi) e al gene pla (il gene che codifica per l'attivatore del plasminogeno) di Y. pestis. Il materiale di partenza, come indicato da questi autori, sarà costituito dalla polpa dentaria. I denti verranno sterilizzati superficialmente, fratturati lungo l'asse longitudinale e i residui di polpa rimossi.
Se le circostanze lo suggeriranno, potranno venire utilizzati anche sistemi cosiddetti "universali". Tali sistemi, largamente sperimentati nel nostro laboratorio, sono basati sulla sequenza del gene procariotico per l'RNA ribosomale 16s. Si procede clonando il DNA amplificato in un vettore plasmidico e determinando la sequenza nucleotidica di un numero relativamente elevato di cloni. Le sequenze così ottenute vengono utilizzate per interrogare le banche dati. Seppur alquanto laboriosa questa procedura ha il vantaggio di rendere possibile lo screening del materiale per uno spettro molto ampio di microrganismi, patogeni e non (Cano et al., 2000; Rollo et al., 2000).
Per la diagnosi del vaiolo si useranno corti (< 150 bp) sistemi di PCR progettati sulla base di geni degli ortopoxvirus come quello codificante l'emoagglutinina e come l'rpo18, gene codificante la subunità di 18-kDa della RNA polimerasi (Schoepp et al., 2004; Nitsche et al., 2004; Ropp et al., 1995).
Dal punto di vista dell'organizzazione del lavoro, i primi 6 mesi del primo anno verranno dedicati alla raccolta e alla catalogazione del materiale. Si procederà poi all'esecuzione del test di diagenesi molecolare basato sull'analisi del grado di racemizzazione dell'acido aspartico. Nel secondo anno si procederà all'estrazione del DNA dai campioni e, sulla base dei riscontri paleopatologici e archeologici, alla ricerca del DNA dei microrganismi.

Analisi antropometrica del ritratto rinascimentale

Il progetto prevede l'esame comparato, mediante tecniche di sovrapposizione cranio-facciale dei crani di una serie di personaggi della dinastia Medici, del secolo XVI, con i rispettivi ritratti pittorici, in particolar modo con quelli eseguiti da Agnolo di Cosimo ("Bronzino") e Jacopo Carrucci ("Pontormo"). Man mano che i resti verranno esumati, verranno eseguite copie tridimensionali virtuali dei crani utilizzando un laser-scanner (Pieraccini et al., 2001) Minolta VIVID 700 3D in possesso dell'unità operativa. Attraverso il computer, utilizzando programmi opportuni, verranno confrontati i modelli 3D dei crani con i rispettivi ritratti. La corrispondenza tra cranio e ritratto verrà valutata seguendo i criteri di coerenza antropometrica stabiliti da Austin-Smith e Maples (1994). Questi criteri considerano 12 punti di corrispondenza nella norma frontale e altrettanti in quella laterale.
Per ogni ritratto considerato verrà preparata una scheda di corrispondenza cranio facciale (Rollo et al., 2005).