RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MALATTIE, AMBIENTE E SOCIETA' ALLA CORTE GRANDUCALE DI FIRENZE: STUDIO STORICO, ARCHEOLOGICO E PALEOPATOLOGICO DELLE DEPOSIZIONI FUNEBRI DEI MEDICI (SECOLI XVI-XVIII)

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - MEDICINA SPERIMENTALE E PATOLOGIA - ROMA(RM)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Laura OTTINI

Descrizione

L'Unità di Ricerca si dedicherà a studi di paleogenetica e paleopatologia molecolare dei reperti scheletrici e mummificati dei Granduchi dei Medici di Firenze focalizzandosi su specifiche patologie infettive e neoplastiche. Tra le malattie infettive verranno studiate la sifilide e la malaria, malattie diffuse in Italia centrale nei secoli XVI-XVIII e che oggi rappresentano patologie riemergenti Italia ed in Europa. Lo studio molecolare sarà condotto al fine di ottenere dati paleogenetici sul Treponema pallidum ed i Plasmodi utili per la definizione dell'origine delle patologie da essi causate, per ottenere dati circa l'antichità, l'evoluzione e la variabilità genetica dei ceppi. Le neoplasie maligne, che rappresentano una causa importante di morbidità e mortalità nelle popolazioni attuali, dovettero essere più rare nel passato in relazione alla diversa struttura d'età della popolazione. In questo progetto, per ovviare alla relativa rarità dei tumori mummificati, si procederà anche all'analisi molecolare dei tumori identificati negli archivi istopatologici dell'Università di Pisa e Firenze e datati tra la fine del XIX e l'inizio del XX secolo, rappresentativi quindi di un'epoca immediatamente successiva a quella in cui vissero i Granduchi dei Medici. Particolare riguardo sarà rivolto ai tumori gastrointestinali e mammari, le cui caratteristiche molecolari in serie epidemiologiche moderne sono relativamente ben note, e quindi suscettibili di fornire punti di riferimento a scopo comparativo. Lo studio molecolare sui resti antichi dei Granduchi dei Medici sarà anche rivolto a fornire informazioni su eventuali relazioni genetiche fra individui, indagabili nella linea materna, attraverso lo studio della regione ipervariabile di controllo del DNA mitocondriale. In collaborazione con il CSPO di Firenze, si condurranno studi comparativi di analisi filogenetica mitocondriale in campioni di popolazione attuale residenti nell'area di Firenze. In fine, in collaborazione con il biorepositorio BioRep di Milano (www.BioRep.it) l'unità di Ricerca si dedicherà alla creazione di una banca biologica di tessuti scheletrici e mummificati.
La Ricerca si articolerà quindi nei seguenti punti:1) verifica dello stato di conservazione del DNA; 2) analisi molecolare delle malattie infettive; 3) analisi molecolare delle malattie neoplastiche; 4) analisi filogenetiche; 5) creazione di un bio-repositorio di materiale biologico antico.
1) Verifica dello stato di conservazione del DNA. La prima fase del programma prevede di verificare lo stato di conservazione delle macromolecole biologiche e la possibile persistenza di informazione genetica nei campioni biologici pertinenti alle deposizioni funebri dei Granduchi dei Medici. Per ogni tessuto campionato verranno eseguiti 4 prelievi distinti, conservati separatamente. Il primo prelievo sarà sottoposto all'analisi biochimica di racemizzazione degli aminoacidi, che fornisce indicazioni sulla possibile conservazione di DNA endogeno. A questo scopo, sarà valutato il grado di racemizzazione degli aminoacidi acido aspartico (Asp), alanina (Ala) e leucina (Leu). La separazione degli enantiomeri dei vari aminoacidi avviene mediante l'utilizzo di un cromatografo liquido ad alta risoluzione (HPLC). I due ulteriori prelievi verranno sottoposti ad indagini paleogenetiche. Il quarto prelievo sarà utilizzato per le correlazioni microscopiche, previa inclusione in paraffina. I risultati ottenuti dall'analisi di racemizzazione degli aminoacidi verranno valutati al fine di procedere alla successiva estrazione ed amplificazione degli acidi nucleici. I campioni che presenteranno un rapporto di racemizzazione degli enantiomeri dell'acido aspartico (D/L Asp) minore di 0.1 verranno sottoposti ad estrazione del DNA. L'estrazione del DNA dai campioni antichi viene eseguita utilizzando il GENECLEAN kit for ancient DNA (BIO101, La Jolla, California, USA), basato sulla metodica pubblicata da Höss & Pääbo. Sulla scorta delle indicazioni biochimiche ottenute dal predetto test, si procederà alla verifica della amplificabilità del DNA endogeno. A questo scopo verrà analizzato il DNA mitocondriale che ha i vantaggi di essere ben caratterizzato e di presentare copie multiple per cellula, condizione che ne favorisce una migliore conservazione nel tempo. In considerazione dell'elevata informatività a livello popolazionistico, si esaminerà la regione ipervariabile di controllo HVRI, che potrà dare informazioni sia sul grado di amplificabilità del DNA antico che sul grado di variabilità genetica delle diverse linee materne esaminate. Per l'analisi dell'intera regione HVRI di 444 paia di basi da DNA antico, la strategia, già messa a punto, prevede l'amplificazione di frammenti di DNA non più lunghi di 183 paia di basi. A tale scopo sono state progettate 3 coppie di primers che permettono di ottenere la sovrapposizione parziale delle regioni di amplificazione. La sovrapposizione permette di escludere varianti nucleotidiche occasionali, non presenti contemporaneamente nella regione di sovrapposizione di prodotti di PCR relativi a segmenti consecutivi. I risultati ottenuti in questa fase del programma permetteranno un'ottimizzazione dei protocolli di PCR, che potranno essere basati sulla previsione a priori della lunghezza dei frammenti di DNA amplificabili.
2) Analisi molecolare delle malattie infettive. Per le ricerche concernenti i patogeni si procederà all'analisi molecolare del Treponema pallidum, agente responsabile della sifilide e dei Plasmodi, agenti responsabili della malaria. Tessuti mummificati ed ossei da tutte le mummie sottoposte a ricognizione da parte dell'Unità di Pisa serviranno per controlli di specificità di amplificazione. In sede di prelievo si userà la massima cura per evitare contaminazioni (strumentazione sterile monouso per ogni prelievo, impiego di indumenti, guanti e mascherine sterili da parte degli operatori). Saranno escluse, mediante raschiamento con lame sterili monouso, tutte le aree superficiali, suscettibili di essere venute a contatto con contaminanti attuali.
L'amplificazione mediante PCR di sequenze Treponema pallidum verrà effettuata utilizzando la coppia di primers specificamente disegnati per amplificare la regione fiancheggiante al 5' della lipoproteina TPP15 come riportato dalla letteratura. Per l'amplificazione molecolare di sequenze riferibili ai Plasmodi verrà analizzata una regione "consenso" altamente omologa nei differenti ceppi. Successive analisi saranno rivolte all'identificazione dello specifico ceppo. In particolare, i campioni di DNA antico verranno analizzati mediante semi-nested PCR usando oligonucleotidi disegnati per amplificare sequenze specie-specifiche del gene che codifica per l'acido ribonucleico della piccola subunità ribosomiale (18S SSU rRNA) conservato per P. falciparum, P. vivax e P. malariae. Nella PCR esterna, eseguita usando primer progettati su regioni conservate, verrà amplificato un frammento di 130 bp del gene 18S di Plasmodium sp. La PCR interna sarà eseguita utilizzando il primer senso esterno in combinazione con ognuno dei primers specie-specifici di P. falciparum, P. vivax e P. malariae in differenti reazioni di PCR. La banda ottenuta sarà di 100 bp per P. falciparum e per P. vivax e 110-115 bp per P. malariae. In alternativa verranno utilizzati anche sistemi cosiddetti "universali". Tali sistemi sono basati sulla sequenza del gene procariotico per l'RNA ribosomale 16s. Si procede clonando il DNA amplificato in un vettore plasmidico e determinando la sequenza nucleotidica di un numero relativamente elevato di cloni. Il clonaggio dei prodotti di PCR è uno strumento necessario per l'analisi del DNA antico, sottoposto a fenomeni di degradazione che possono portare ad un incremento significativo della frequenza di sostituzioni nucleotidiche occasionali nei prodotti di PCR. Il clonaggio sarà effettuato con il Kit TOPO-TA cloning DUAL PROMOTER (Invitrogen Corporation, California, USA), che utilizza il plasmide TOP10F' come vettore. Il DNA plasmidico ottenuto viene propagato tramite trasformazione, amplificato ed isolato seguendo il protocollo fornito con il Kit Miniprep Plasmid (100) (Quiagen Inc., Chatsworth, CA, USA). Allo scopo di verificare lo stato di trasformazione delle colonie, il DNA plasmidico è sottoposto a reazione di PCR utilizzando gli stessi primers specifici originariamente impiegati. I prodotti di PCR ottenuti sono infine sottoposti ad analisi di sequenziamento automatico. Le sequenze dei cloni ottenuti verranno in seguito confrontate, al fine di discriminare le varianti nucleotidiche comuni a tutti cloni esaminati dalle sostituzioni nucleotidiche occasionali, dovute ai processi di degradazione del DNA antico. In tutti i casi, i prodotti di amplificazione saranno sottoposti a sequenziamento diretto, mediante Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit/Amplitaq FS (PE-Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). I prodotti di sequenza saranno visualizzati sia usando un sequenziatore automatico (ABI-PRISM 310, Applied Biosystems), che attraverso sequenziamento manuale secondo Sanger. I primers utilizzati per il sequenziamento corrisponderanno agli stessi oligonucleotidi usati per le reazioni di PCR. Per il DNA mitocondriale i risultati verranno comparati con la sequenza di riferimento di Anderson (Anderson et al.,1981) utilizzando il software GeneWorks 2.2 (Intelligenetics Inc., Mountain View, CA, USA) allo scopo di evidenziare le varianti nucleotidiche caratterizzanti l'aplotipo degli individui mummificati sottoposti a studio. Analoghe metodologie saranno impiegate per le analisi filogenetiche di sequenze genomiche di microrganismi patogeni. Specifici programmi di genetica popolazionistica (MacPairwise, Arlequine, Clustal, MacVector) potranno permettere di ricavare informazioni dal confronto delle sequenze antiche con le sequenze attuali. In particolare, lo sharing tra le sequenze dei parassiti ottenute da resti antichi e le sequenze moderne presenti in GenBank sarà ottenuto mediante Arlequin 2000. L'albero cladistico sarà costruito mediante algoritmo neighbor-joining usando il software PHYLIP 3.6 Inference Package. Le matrici di distanza saranno calcolate utilizzando il modello F84 corretto con il parametro della distribuzione gamma che tiene conto del tasso di eterogeneità. I parametri gamma ed alfa-transizione/transversione saranno stimati con TREE-PUZZLE 5.0. La significatività sarà determinata dalla percentuale del valore di bootstrap ottenuto dopo replicazione casuale di 1000 alberi. Inoltre, per ottenere networks filogenetici sarà usato il software DnaSP v.4.2 (http://www.ub.es/dnasp/) per identificare varianti segreganti nelle sequenze. Tabelle di varianti saranno usate come file di input per il programma NETWORK 4.108 (Fluxus Tecnology Ltd). Il tempo d'insorgenza dei clades dei parassiti verrà stimato calcolando il rho statistico sulla base della variabilità delle sequenze e della deviazione standard come descritto da Foster et al. (Am J Hum Genet 59: 935, 1996) e da Saillard et al. (Am J Hum Genet 67: 718, 2000), con il metodo implementato in NETWORK 4.108. In tutti i casi, i dati molecolari verranno considerati validi solo se indipendentemente replicati con estratti e reagenti diversi.
3) Analisi molecolare delle neoplasie. Le diagnosi morfologiche macroscopiche e microscopiche (Unità di Ricerca di Pisa) costituiranno la base degli studi di paleopatologia molecolare effettuati sulle neoplasie benigne e maligne mummificate, da cui si otterranno in ogni caso prelievi se possibile multipli, corredati di campioni di tessuto normale (osso, muscolo scheletrico) dello stesso individuo. Analogamente si procederà alla ricognizione dei preparati istologici rappresentativi di tumore conservati presso gli archivi di anatomia patologica dell'Università di Pisa e Firenze. I tumori maligni, con particolare riferimento alle neoplasie gastrointestinali, saranno sottoposti ad analisi mutazionale per la ricerca di specifiche mutazioni tumore-associate nei geni p53 (esoni 5-8)e K-ras (codoni 12-13 e 61). Le aree tumorali saranno microdissezionate con microscopio binoculare in un locale appositamente dedicato, sterilizzato prima di ciascun prelievo mediante esposizione a radiazioni UV di 254 nm di lunghezza d'onda. L'analisi mutazionale,sarà effettuata mediante amplificazione in vitro con PCR esterna ed interna e successivo screening mutazionale via DHPLC e/o sequenziamento nucleotidico. I "primers" senso ed antisenso utilizzati per le amplificazioni primarie saranno disegnati in modo da prevedere l'amplificazione di frammenti parzialmente sovrapposti non superiori alle 180-200bp.
4) Analisi filogenetiche. Lo studio molecolare sarà rivolto a complessi di resti umani mummificati e scheletrici dei Granduchi dei Medici al fine di fornire informazioni su eventuali relazioni genetiche fra gli individui, indagabili nella linea materna, attraverso lo studio della regione ipervariabile di controllo del DNA mitocondriale. La ricerca verrà effettuata attraverso il confronto diacronico di segmenti antropologicamente informativi del genoma mitocondrale, come le regioni non codificanti D-loop (I e II) e COII/tRNAlys, ottenute dai resti antichi dei Granduchi dei Medici. In collaborazione con la dott.ssa Giovanna Masala del CSPO di Firenze (Centro Studi per la Prevenzione Oncologica) si effettueranno inoltre studi comparativi tra gli aplotipi mitocondriali dei Medici e quelli di un campione di popolazione attuale dell'area di Firenze. Tali studi permetteranno di valutare quale sia l'effettivo contributo genetico della Famiglia dei Medici al pool genico della popolazione dell'area fiorentina attuale.
5) Creazione di un biorepositorio di reperti umani antichi. L'Unità di Ricerca in collaborazione con il Prof. Pasquale De Blasio, direttore di BioRep, Milano (www.BioRep.it) sarà impegnata nella creazione di una banca di tessuti umani antichi a partire dai reperti scheletrici e mummificati dei Granduchi dei Medici. BioRep in collaborazione con il Coriell Institute for Medical Research, Camden USA (www.coriell.org), è una struttura che provvede alla criopreservazione di materiale biologico, fornisce servizi di biologia cellulare e molecolare, produce kits e reagenti di biologia molecolare e fornisce servizi altamente specializzati a livello Europeo. In questo progetto ci si propone di creare una banca biologica centralizzata di tessuti antichi con sede presso la BioRep di Milano al fine di conservare e preservare in condizioni ottimali il materiale biologico antico (tessuti mummificati, scheletrici, DNA antico), di verificare nuovi protocolli di estrazione di acidi nucleici specificamente disegnati per DNA antico, attuare programmi controllo di qualità. Ciascun campione biologico antico che entrerà a far parte della banca centralizzata sarà corredato di informazioni di carattere storico raccolte nel corso del progetto di ricerca. Inoltre, particolare riguardo verrà rivolto anche agli aspetti etici e legali legati alla conservazione e all'uso di materiale biologico umano a scopi di ricerca.