RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Sindromi Mielodisplastiche: modelli patogenetici e nuove possibilità terapeutiche

Università di riferimento

Università Cattolica del Sacro Cuore - Ematologia - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Giuseppe LEONE

Descrizione

Lo scopo del nostro studio è la valutazione dello stato di metilazione del promotore di una varietà di geni nelle sindromi mielodisplastiche e nelle leucemie secondarie, anche in relazione alla possibilita' di trattamento di queste patologie mediante agenti demetilanti asoociati o meno a inibitori dell'istone deacetilasi.

Obiettivo 1
STUDIO DELLA METILAZIONE DEL PROMOTORE DI GENI IMPORTANTI PER LA RIPARAZIONE DEL DNA.
Tra i geni importanti per la riparazione del DNA, studieremo BRCA-1 e MGMT.
BRCA1 e' un gene le cui mutazioni sono importanti per la suscettibilita' al cancro della mammella e dell'ovaio familiari. Diversi lavori suggeriscono che l'ipermetilazione del promotore, che risulta nella ridotta espressione della proteina, potrebbe essere frequente nei tumori della mammella e dell'ovaio sporadici. Studieremo l'eventuale ruolo della metilazione come oncosoppressore nelle MDS e s-AML.
O6-Metilguanina-DNA metiltrasferasi (MGMT) e' un enzima di riparazione del DNA che trasferisce i gruppi metilici e alchilici dalla posizione O6 della guanidina a una cisteina, inibendo il danno cellulare da alchilanti. L'ipermetilazione delle regioni CpG della regione promoter di questi geni risulta nel silenziamento dell'espressione della proteina stessa, che si propaga attraverso la mitosi grazie all'azione delle DNA-metiltrasferasi.
La metilazione aberrante del DNA potrebbe svolgere un ruolo importante nella induzione della displasia dei progenitori ematopoietici e la conseguente trasformazione maligna.

PCR METILAZIONE-SPECIFICA. Tutti gli studi sullo stato di metilazione dei promotori dei vari geni verranno eseguiti utilizzando una PCR su DNA modificato dal trattamento con la sodio bisolfite, che converte tutti i siti CpG non metilati in UpG, lasciando le CpG metilate intatte. Il DNA viene quindi amplificato usando primer specifici per i geni di interesse. La PCR viene eseguita in un volume di 25 ul, che contiene 100 ng di DNA trattato, 1.25 mM dNTP, 5.5 mM MgCl2, 1 nmol primer, 1 U Taq polymerase e i primer specifici per le sequenze metilate e non metilate dei promotori di GSTP1, MGMT e DAP-kinasi.
Il profilo "metilante" verra' quindi correlato alle caratteristiche cliniche dei pazienti, incluse età, sesso, tipo di MDS, citogenetica, conta leucocitaria, che saranno incluse come covariabili insieme a tutti i genotipi studiati e le possibili interazioni. La presenza di metilazione del promoter, quale indicatore di un diverso metabolismo dei farmaci antiblastici, verra' inoltre correlata alla risposta al trattamento e alla trasformazione in fenotipi piu' aggressivi.

Verranno usati campioni di midollo dei pazienti come sorgente di DNA prima dell'inizio della chemioterapia. Per escludere potenziali "bias" nella distribuzione dei sottotipi di MDS e s-AML per stabilire una associazione con il pattern di metilazione è richiesto un numero minimo di circa 150 pazienti. La collaborazione dei centri partecipanti a questo progetto di ricerca è un prerequisito per includere un tale numero di pazienti nel giro di 2 anni. Inoltre allargheremo il nostro studio di popolazione con una analisi retrospettiva dei pazienti trattati in passato, utilizzando la banca di DNA che gia' e' presente nel nostro centro e che contiene circa 100 campioni di MDS e 30 campioni di s-AML.

Ipermetilazione di BRCA-1
La metilazione del promotore di BRCA1 verra' studiata mediante MSP dopo trattament del DNA con bisolfite, come descritto in precedenza (Esteller et al, 2000). La sequenza dei primer per la reazione non-metilata e' 5'-TTG GTT TTT GTG GTA ATG GAA AAG TGT-3' (sense) e 5'-CAA AAA ATC TCA ACA AAC TCA CAC CA-3' (antisense) e per la reazione "metilata" 5'-TCG TGG TAA CGG AAA AGC GC-3' (sense) and 5'-AAA TCT CAA CGA ACT CAC GCC G-3' (antisense). Il prodotto di PCR non-metilato e' di 86 bp, mentre il prodotto metilato e' di 75 bp. L'espressione dell'mRNA per BRCA-1 verra' valutata mediante RT-PCR sull'RNA estratto alla diagnosi, come descritto(Kawakami et al, 2003), utilizzando i seguenti primer, che si trovano negli esoni 18 e 23 di BRCA-1: sense 5'-ATG CTG AAT GAG CAT GAT TTT G-3' e antisense 5'-AGA GTG CTA CAC TGT CCA AC-3'. L'amplificazione produce un frammento di 351 bp, che verra' visualizzato su un gel di agarosio al 2%, colorato con bromuro d'etidio. ‘espressione di BRCA-1 verra' correlata ai dati sulla metilazione del promotore.


Ipermetilazione di MGMT
La MSP per MGMT verra' eseguita dopo trattamento con sodio-bisolfite, secondo la metodica di Esteller et al (2002). Le sequenze dei primer per la reazione non-metilata sono: 5`-TTT GTG TTT TGA TGT TTG TAG GTT TTT GT-3` (forward) and 5`-AAC TCC ACA CTC TTC CAA AAA CAA AAC A-3` (reverse); mentre per la reazione metilata sono: 5`-TTT CGA CGT TCG TAG GTT TTC GC-3` (forward) and 5`-GCA CTC TTC CGA AAA CGA AAC G-3` (reverse).

Obiettivo 2
IPERMETILAZIONE DI GENI IMPORTANTI PER IL CONTROLLO DEI PROCESSI ANGIOGENETICI NELLE MDS: COX-2 E TROMBOSPONDINA
E' stato dimostrato che l'angiogenesi svolge un ruolo importante nella patogenesi delle sindomi mielodisplastiche.
Tra i geni importanti per il controllo dei processi angiogenetici nelle MDS studieremo COX-2, un fattore proangiogenico e la Trombospondina, con funzione anti-angiogenica.
COX-2 è un gene che codifica per una isoforma delle ciclossigenasi, rapidamente indotta da stimoli sia infiammatori che mitogeni, che determina un'aumentata produzione di prostaglandine nei tessuti infiammatori e neoplastici. Le prostaglandine, in particolare le PGE2, possono indurre angiogenesi stimolando la produzione di fattori pro-angiogenetici, come l'endothelial growth factor. Studieremo l'eventuale ruolo della metilazione nella modulazione dell'espressione di COX-2 nelle MDS.
Le trombospondine sono una famiglia di potenti inibitori dell'angiogenesi attraverso diversi meccanismi, che includono l'interazione diretta con il vascular endothelial growth factor (VEGF), l'inibizione dell'attivazione delle metalloproteinasi 9 e della migrazione delle cellule endoteliali e l'induzione dell'apoptosi di queste ultime. Diversi lavori dimostrano che l'ipermetilazione del promoter di questi geni, con conseguente ridotta espressione della proteina, è frequente in alcuni tipi di tumori, come il neuroblastoma, il carcinoma gastrico, l'adenocarcinoma endometriale.
La metilazione del gene della trombospondina potrebbe svolgere un ruolo importante nel favorire i processi angiogenetici nelle MDS.

Ipermetilazione di COX-2
La metilazione del promotore di COX-2 verra' studiata mediante MSP dopo trattamento del DNA con bisolfite, come descritto in precedenza (Hoon Kang et al., 2003). La sequenza dei primer per la reazione non-metilata e' 5'-ATAGATTAGATATGGTGGTGGTGGT-3' (sense) e 5'-CACAATCTTTACCCAAACACTTCCA-3' (antisense) e per la reazione "metilata" 5'-TTAGATACGGCGGCGGCGGC-3' (sense) and 5'-TCTTTACCCGAACGCTTCCG-3' (antisense). Il prodotto di PCR non-metilato e' di 171 bp, mentre il prodotto metilato e' di 161 bp.

Ipermetilazione della trombospondina.
La MSP per MGMT verra' eseguita dopo trattamento con sodio-bisolfite, secondo la metodica di Yang et al (2003). Le sequenze dei primer per la reazione non-metilata sono: 5`-GAATGTGAGTGTTTTTTTAAATGTG-3` (forward) and 5`-CCTAAACTCACAAACCAACTCAA-3` (reverse); mentre per la reazione metilata sono: 5`-TGCGAGCGTTTTTTTAAATGC-3` (forward) and 5`-TAAACTCGCAAACCAACTCG-3` (reverse).
Il prodotto di PCR non-metilato e' di 78 bp, mentre il prodotto metilato e' di 74 bp.


Obiettivo 3
VALUTAZIONE FUNZIONALE DELL'IPERMETILAZIONE DI DAP-KINASI NELLE MDS IN TRATTAMENTO CON AGENTI DEMETILANTI IN-VITRO E IN VIVO.
Le alterazioni genetiche che coinvolgono la regolazione del ciclo cellulare e l'apoptosi possono influenzare la sopravvivenza cellulare, la risposta cellulare alla chemioterapia ed alle radiazioni ionizzanti. DAP-chinasi e' una serina/treonina chinasi regolata dalla calmodulina, che partecipa a una serie di sistemi apoptotici innestati da interferone-gamma, TNF-alpha, Fas, e dal distacco dalla matrice cellulare. Abbiamo dimostrato che DAP-kinasi e' metilata in quasi il 50% delle MDS e delle s-AML, indicando il blocco della sua funzione come un possibile meccanismo patogenetico in queste malattie. Studieremo la metilazione DAP-kinasi e i suoi effetti funzionali sulle cellule primarie di pz con MDS e s-AML, trattate mediante agenti demetilanti e inibitori dell'istone acetilasi.

DISEGNO SPERIMENTALE
Per studiare il ruolo funzionale della metilazione di DAP-kinasi sull'espressione genica, le cellule CD34+ separate da pazienti con MDS/s-AML verranno trattate con 5-aza-2'deoxycitidine, in RPMI1640/10%FBS a diverse concentrazioni del farmaco (da 100 nM a 1 μM). Verra' quindi valutato quantitativamente mediante Real-Time PCR l'effetto demetilante su DAP-kinasi e il correspondente aumento di espressione dell'mRNA .
Inoltre, per studiare l'effetto pro-apoptotico dell'induzione di espressione di DAP-kinasi, la proporzione di cellule apoptotiche verra' valutata utilizzando il Kit di marcatura Annexin-V-FLUOS Staining Kit (Roche, Mannheim, Germany) in citofluorimetria.



Obiettivo 4
VALUTAZIONE DELL' EVOLUZIONE CLONALE DEI DIVERSI TIPI DI MIELODISPLASIA E CORRELAZIONE CON IL PATTERN DI METILAZIONE E LA RISPOSTA AL TRATTAMENTO.
Obiettivo del nostro studio sarà valutare la clonalità dell'emopoiesi nelle pazienti che dopo trattamento chemioterapico otterranno la remissione completa morfologica. Valuteremo il X-CIP dei granulociti del sangue periferico e delle cellule mononucleate del midollo osseo utilizzando a tale scopo una tecnica che studia il polimorfismo del primo esone del gene del recettore umano degli androgeni (HUMARA). Per eludere il rischio di considerare clonale uno sbilanciamento acquisito o costituzionale utilizzeremo i linfociti del sangue periferico come tessuto normale di controllo.

DISEGNO SPERIMENTALE
Il sangue periferico verrà sedimentato su Fycoll e la frazione dei linfociti sarà purificata utilizzando un anticorpo anti CD3 coniugato con fluoresceina isotiocianato. I globuli rossi in eccesso presenti nella frazione dei neutrofili saranno rimossi con soluzione di lisi ipotonica. Le cellule mononucleate del midollo osseo saranno ugualmente separate mediante stratificazione su Fycoll.
Il DNA genomico verrà estratto da tutte le frazioni secondo metodica standard. Dopo l'estrazione il DNA sarà risospeso in dH2O, e successivaente digerito con enzimi di restrizione RsaI e HpaII. Il prodotto di tale digestione sara' quindi aggiunto ad una reazione di PCR con 10pmol di ogni primer (hum1-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC e hum2-GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT) che amplificano il primo esone del gene HUMARA e successivamente tale reazione sarà sottoposta ad esame di analisi di frammenti che metterà in evidenza la clonalità della popolazione cellulare studiata.