RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Sindromi Mielodisplastiche: modelli patogenetici e nuove possibilità terapeutiche

Università di riferimento

Università degli Studi di PERUGIA - MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE - PERUGIA(PG)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Cristina MECUCCI

Descrizione

La presente Unità ha sviluppato negli ultimi anni un approccio integrato di citogenetica convenzionale e molecolare nelle emopatie maligne, ivi comprese tutte le più recenti metodologie che consentono l'analisi del genoma attraverso le tecnologie del DNA. In particolare sono state messe a punto ed ampiamente applicate l'ibridazione in situ in fluorescenza, sia in metafase che in interfase, con sonde centromeriche, painting e locus specifiche; la multicolor FISH per un cariotipo con colorazione differenziata delle singole coppie di cromosomi; la CGH, o Comparative Genomic Hybridization su metafasi, specifica per l'identificazione degli sbilanciamenti genomici, sia in metafase che con microarrays; la FICTION, con l'utilizzo simultaneo della FISH in interfase e di anticorpi monoclonali per antigeni specifici dei diversi stadi di differenziazione cellulare. Parallelamente l'Unità ha sviluppato metodiche di biologia molecolare finalizzate al clonaggio dei geni coinvolti nei riarrangiamenti tipici e all' analisi mutazionale sia per sequenziamento che DHPLC.
Nel presente progetto ci si propone di utilizzare gli approcci sopra elencati nelle sindromi mielodisplastiche e disordini correlati applicando i criteri classificativi adottati dalla WHO e di cui, a tutt'oggi, non esiste informazione definitiva sugli eventi genetici causali. Le malattie su cui saranno particolarmente rivolte le nostre indagini comprendono le entità WHO classificate come anemia refrattaria (RA), citopenia refrattaria con mielodisplasia (RCMD), anemia refrattaria con sideroblasti ad anello (RARS) e citopenia refrattaria con mielodisplasia e sideroblasti ad anello (RCMD-RS), con lo scopo di precisare se alla definizione morfologica corrisponda una precisa etichetta citogenetico-molecolare. Inoltre saranno incluse entità "non classificabili" (U - unclassifiable); e entità "borderline", con caratteristiche morfologiche comuni sia a sindromi mieloproliferative che a sindromi mielodisplastiche (MDS/MPD, inclusa la leucemia mieloide cronica atipica).
Altre entità incluse nel nostro studio, comprese nella WHO, sono condizioni rare come la leucemia neutrofilica cronica, nell'ipotesi che alcuni geni MDS possano essere coinvolti anche in altre patologie mieloidi croniche rare, e viceversa.
La patologia mielodisplastica sarà anche distinta in relazione all'insorgenza apparentemente de novo rispetto a quella di provata natura secondaria, nella fattispecie casi insorti a seguito di trattamenti chemio- e/o radio-terapici o dopo esposizione a tossici conosciuti. E' noto infatti che nelle mielodisplasie secondarie si osservano percorsi patogenetici citogenetico/molecolari peculiari con l'interessamento privilegiato dei cromosomi 3,5,7,12, 17 e 21, nonché dei geni p53, MLL o AML1. Data l'associazione citogenetica con cariotipi complessi, è plausibile che ulteriori eventi molecolari caratteristici possano emergere da studi molecolari indirizzati sulla base della citogenetica convenzionale.
Una considerazione importante è che i rapidi avanzamenti degli studi sul genoma delle neoplasie umane degli ultimi anni sono in larga misura legati allo sviluppo continuo di nuove tecnologie sempre più precise e capaci di individuare le anomalie sia nella struttura del genoma che nella sua funzione. Per tale ragione la presente proposta prevede lo sviluppo di ulteriori arricchimenti tecnologici a integrazione di quelli già esistenti, in particolare l'utilizzo di microarrays per la CGH in sottogruppi selezionati sulla base della lesione genomica. A tutt'oggi le informazioni dell'applicazione di tale tecnologia nelle sindromi mielodisplastiche sono scarsissime, mentre risultati interessanti sono attesi proprio in considerazione del fatto che le sindromi mielodisplastiche sono geneticamente raggruppate tra le malattie di delezione cromosomica.

Obiettivi:

1) DEFINIZIONE BIOLOGICA DELLE SINDROMI MIELODISPLASTICHE CON CLASSIFICAZIONE WHO "GENETICAMENTE INCOMPLETA".
Questa parte del progetto è concepita per la scoperta di nuovi marcatori citogenetico-molecolari capaci di arricchire la classificazione WHO di nuove entità.
a) identificazione molecolare di nuove lesioni genomiche e/o criptiche sia nei casi con anomalie cariotipiche che nei casi falliti o normali alla citogenetica convenzionale.
b) caratterizzazione, attraverso studi di FISH in interfase, delle dimensioni del(i) clone(i) neoplastico;
c) ricerca delle correlazioni tra ricombinazioni genomiche ricorrenti e aspetti morfologici ed immunologici specifici sulla base della WHO.
d) caratterizzazione dei precursori ematopoietici bersaglio delle specifiche lesioni genetiche clonali attraverso la FISH in interfase applicata simultaneamente ad anticorpi monoclonali e/o dopo separazione con immunomagneti o cell sorter.

2) SOTTOPROGETTI "ad hoc" PER L'INDIVIDUAZIONE DEL RUOLO DI NUOVI GENI E DEI MECCANISMI MOLECOLARI SOTTOSTANTI SINDROMI MIELODISPLASTICHE E ALTRE NEOPLASIE MIELOIDI CORRELATE.
Questa parte del progetto è finalizzata a produrre nuove conoscenze biologiche su geni e molecole critiche nella patogenesi di sottogruppi di SMD nell'intento di disegnare nuove strategie terapeutiche mirate.
a) caratterizzazione delle aberrazioni di 11p15 con sonde di FISH per il gene NUP98 alla ricerca di riarrangiamenti strutturali criptici e di nuovi geni partners di traslocazioni.
b) analisi molecolare della t(2;11)nelle sindromi mielodisplastiche.
c) analisi in CGH, Comparative Genomic Hybridization, e FISH in metafase delle sindromi mielodisplastiche a cariotipo complesso per la caratterizzazione molecolare degli sbilanciamenti genomici.

3)ANALISI DELLE SINDROMI MIELODISPLASTICHE CON LA CGH IN MICROARRAYS.
La CGH in microarrays aumenta il potere di risoluzione della CGH in metafase e sarà utilizzata in casistiche selezionate, in particolare nei casi normali o con sospetto di sbilanciamenti alla CGH in metafase.
Gli studi di espressione saranno applicati in casistiche selezionate, in particolare al fine di una caratterizzazione funzionale delle entità definite geneticamente.

Materiali e Metodi

Circa 800 pazienti con MDS sono stati sottoposti ad analisi di citogenetica convenzionale nel nostro laboratorio negli ultimi 15 anni. Un'informazione completa di dati ematologici, clinici e citogenetici è attualmente disponibile in oltre 600 casi. Di questi casi è disponibile una banca di materiale per ulteriori investigazioni, inclusi pellets per citogenetica molecolare e cellule vitali congelate per CGH, FICTION e altre indagini molecolari. In prospettico, tutti i casi regolarmente sottoposti a indagini diagnostiche nei due Centri vengono arruolati nel presente progetto.
Inoltre l'Unità proponente svolge attività di consulenza e di collaborazione scientifica per l'analisi molecolare per altri centri che sottopongono casi sia a livello nazionale (Ematologia Università di Firenze, di Sassari, di Bari, di Brescia, di Palermo) che internazionale (Hematologia Hospital San Pau di Barcellona; Demokritos Research Center di Atene). La casistica relativa al gene NUP98 viene raccolta su scala europea sulla base di un progetto coordinato dal responsabile di codesta unità nell'ambito del network di eccellenza per le leucemie del programma FP6 della Commissione Europea, Workpackage 11.

Ibridazione in situ in fluorescenza (FISH)

La tecnica di ibridazione in situ in fluorescenza si basa sull'utilizzo di sonde di DNA complementari a specifiche regioni di DNA genomico (Lichter et al, 1991).
Per essere utilizzate in FISH le sonde devono essere marcate mediante l'incorporazione di nucleotidi direttamente marcati con fluorocromi (Texas-Red, Fluoresceina, FluorX, Amca, Cy3, Cy5, Cy5.5), o marcati con apteni quali la biotina o la digoxigenina. La sostituzione dei nucleotidi viene ottenuta con procedure di tipo enzimatico, come la nick translation.
Brevemente, i vetrini vengono pretrattati con RNAsi e pepsina o con proteinasi K ; il DNA target e la sonda selezionata vengono denaturate, ad alta temperatura, in una soluzione di formamide. Segue un'incubazione a 37°C per l'ibridazione con la sonda. I lavaggi post-ibridazione vengono effettuati in condizioni di stringenza variabile.
Dopo l'ibridazione le sonde, legate ad apteni (digoxigenina o biotina), vengono rivelate attraverso l'utilizzo di molecole coniugate a fluorocromi. Per l'ibridazione di sequenze molto piccole, al fine di amplificare l'intensità del segnale, viene praticato un secondo step con anticorpi.

Sonde

Le seguenti sonde sono distribuite in commercio: sonde per le regioni centromeriche, sonde per le regioni telomeriche, sonde per intere regioni cromosomiche (WCP) o specifiche per il braccio lungo o il braccio corto di un determinato cromosoma, sonde per geni frequentemente coinvolti nelle principali traslocazioni, inversioni o delezioni.
Tutte le altre sonde locus specifiche (PAC, BAC, cosmidi) vengono preparate nel laboratorio proponente, dopo crescita e marcatura del DNA da cloni ottenuti da librerie genomiche internazionali quali quelle rese disponibili dallo Human Genome Project, o di altri laboratori nazionali o internazionali con i quali l'unità operativa ha rapporti di collaborazione scientifica.
Al momento attuale è già disponibile una banca di circa 1500 sonde marcate e validate per la FISH in metafase, corrispondenti a oltre 200 regioni cromosomiche coinvolte in riarrangiamenti leucemici.

Multicolor-FISH

Vengono utilizzati kit Spectra Vision e Metasystem costituiti da una miscela di sonde painting direttamente legate a fluorocromi che permettono una precisa identificazione di ciascuna coppia di cromosomi omologhi umani. I vetrini, ottenuti a partire dai pellets citogenetici, vengono pretrattati con RNAsi e pepsina e denaturati in una soluzione di formamide a 73°C per 5 minuti. Le sonde, montate sui vetrini, vengono incubate a 37°C overnight. I lavaggi post- ibridazione vengono eseguiti in linea con quanto suggerito dalla ditta fornitrice. L'analisi viene esegiuta con l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza Olympus o Zeiss forniti di una CCD, di un software di analisi di immagine, e di un set di filtri specifico per cinque diversi fluorocromi, più un filtro dapi (4,6-diamino-2-phenylindole, dihydrochloride).

FICTION

Nel primo passaggio i vetrini vengono fissati in acetone a temperatura ambiente e asciugati. Segue un'incubazione di 30 minuti con un anticorpo monoclonale non marcato specifico per l'antigene di interesse, e 3 incubazioni con anticorpi policlonali legati a flouorocromi quali AMCa o CY3 (capra anti-topo, coniglio anti-capra, scimmia anti-coniglio). Dopo fissazione in metanolo: acido acetico, 3:1 per 10 minuti e un passaggio in paraformaldeide 1% per 10 minuti, si esegue un lavaggio in acqua e deidratazione in gradiente di etanolo. La denaturazione dei vetrini e delle sonde avviene simultaneamente su piastra termostatata a 73°C, l'ibridazione overnight a 37°C. Dopo la rivelazione, attraverso l'utilizzo di uno o due passaggi con anticorpi monoclonali legati a fluorocromi, l'immunofenotipo e i segnali fluorescenti dell'ibridazione vengono valutati simultaneamente attraverso l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza equipaggiato di un appropriato set di filtri.

Comparative Genomic Hybridization (CGH) in metaphase and in microarrays.

I due DNA, tumorale e normale, sono marcati direttamente, usando il metodo di nick traslation, con una miscela di nucleotidi cCTP e dUTP legati a fluorocromi. 25 microlitri di Cot-1 DNA umano non marcato viene unito ad una quantità uguale (800 ng) di DNA da studiare e DNA di riferimento. Le sonde sono dissolte nel buffer di ibridazione e denaturate a 75°C. Le metafasi per l'ibridazione sono ottenuta da colture di sangue periferico di maschi normali, stimolate con fitoemoagglutinina. I vetrini sono invecchiati per una notte a 60°C e fissati per una notte in metanolo/acido acetico (3:1) a 4°C. dopo un pretrattamento proteolitico con proteinasi K, i vetrini sono denaturati per 2 minuti a 68°C in soluzione di formamide al 70%/2XSSC. L'ibridazione si esegue in camera umida, a 37°C per 48-72 ore.
Dopo deidratazione in etanoli a concentrazioni scalari, i cromosomi sono controcolorati con DAPI dissolto in una soluzione di "antifade" (Vectashield, Vector).
Viene utilizzato un software di analisi di immagine Applied Imaging. Le metafasi sono esaminate utilizzando appropriate condizioni con tre differenti frequenze di eccitazione corrispondenti al DAPI, alla FITC e al Texas Red. Le regioni cromosomiche sono considerate sovra-rappresentate se il rapporto verde/rosso eccede 1,18 e sotto-rappresentate se il rapporto verde rosso è inferiore a 0,83, sulla base di profili ottenuti da controlli normali. Le regioni centromeriche, le regioni eterocromatiche dei cromosomi 1,9, 16 e Y, e le regioni telomeriche sono escluse dall'analisi per la possibilità di falsi positivi.
La CGH in microarrays permette di ottenere un'analisi genomica completa basata su centinaia di BAC specifici per geni/regioni del genoma umano. In un singolo esperimento è possibile ottenere informazioni su sbilanciamenti dell'intero genoma.
Il principio della metodica è identico a quello della CGH in metafase per ciò che attiene la miscela di ibridazione.
Noi utilizziamo il kit di 3000 BACS Spectralgenomics(TX,USA).
Per l'analisi si utilizza lo Scanner GenePix 4000B (Axon Instruments, Inc, CA, USA).