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UNITA' DI RICERCA
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Bibliografia
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Programma di ricerca
Sindromi Mielodisplastiche: modelli patogenetici e nuove possibilità terapeuticheUniversità di riferimento
Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata" - BIOPATOLOGIA E DIAGNOSTICA PER IMMAGINI - ROMA(RM)Responsabile dell'Unità di ricerca
Sergio AMADORIDescrizione
OBIETTIVIIl progetto si propone di studiare le alterazioni fenotipiche delle sindromi mielodisplastiche con particolare riguardo allo studio di molecole di adesione, antigeni di differeziazione e di marcatori apoptotici nelle sindromi mielodisplastiche (SMD).
I principali obiettivi sono:
1.Determinare il "pattern" fenotipico di espressione di molecole di adesione (Lecam1, ICAM1, VLA-4, VLA-5, Thy1 CD90) e antigeni differenziativi (CD45, CD34, HLA-DR, CD13, CD33, CD15, CD11b, CD16) da parte di cellule midollari di pazienti affetti da SMD, utilizzando come gruppi di confronto campioni di midollo ottenuti da pazienti affetti da leucemie mieloidi acute de novo e midolli di soggetti normali. Tale fase consentirà anche di verificare se le SMD esprimono gli antigeni in studio in modo aberrante e, se questo è il caso, verificare se questi "pattern" aberranti possano essere sfruttati ai fini della identificazione della malattia minima residua dopo trattamento;
2.Studiare le alterazioni della apoptosi mediante analisi di proteine quali apo/fas (CD95), bax, bcl-2, annessina V e Caspasi-3;
3.Determinare se le eventuali alterazioni nella espressione di molecole di adesione e del fenomeno apoptotico abbiano rilevanza prognostica, identificando così categorie di pazienti a maggiore o minore rischio;
4.Determinare se esista correlazione fra alterazioni nella espressione di molecole di adesione, alterazioni della apoptosi ed altri parametri prognostici quali cariotipo e categoria FAB/WHO;
5.Monitorare da un punto di vista biologico i pazienti durante terapia con Infliximab (SMD a basso rischio) o con agenti ipometilanti (SMD ad alto rischio) per verificare gli effetti di tali farmaci come "biologic modifiers";
6.Analizzare possibili correlazioni tra gli effetti biologici indotti dal trattamento e "outcome" clinico.
7.Banking di materiale biologico (siero, acidi nucleici, cellule midollari) per futuri studi (analisi di citochine, analisi genetico-molecolari).
PROCEDURE
Le SMD saranno inquadrate secondo i correnti criteri proposti dalla classificazione FAB E WHO. Le cellule mononucleate da campioni di sangue midollare saranno separate mediante gradiente di densità Fycoll-Hypaque e lavate 3 volte in soluzione tamponata fosfato-salina (PBS). I campioni verranno analizzati entro 24 ore dal prelievo, o criopreservati in "fetal calf serum" al 10% e dimetilsulfossido al 10% ed analizzati in seguito dopo rapido scongelamento. Tramite test di esclusione del Trypan Blue sarà valutata la vitalità che dovrà essere superiore al 90%. Prima dell'incubazione con gli anticorpi specifici le cellule saranno cimentate, per 10 min a temperatura ambiente, con siero umano AB alla concentrazione di 100 microL/mL per minimizzare l'azione di legame aspecifico dovuta alla presenza di recettori Fc. Dopo un ulteriore lavaggio le cellule verranno sospese in PBS alla concentrazione finale di 10e7/mL. Gli antigeni di membrana verranno valutati mediante procedure di tripla/quadrupla marcatura in immunofluorescenza utilizzando anticorpi monoclonali (MoAb) coniugati con ficoeritrina, fluoresceina isotiocianato, peridin clorofil proteina e alloficocianina. Saranno testati i seguenti MoAb specifici per molecole di adesione e markers differenziativi: CD45, CD34, HLA-DR, CD13, CD33, CD15, CD11b, CD16 (Becton Dickinson); CD49b, CD49d, CD11b, Lecam-1 (CD62L), CD18 (Immunotech); CD49f, Thy-1(CD90) (Pharmingen). Una serie preliminare di esperimenti di titolazione consentirà di stabilire la concentrazione ottimale di MoAb da utilizzare. Ciascun MoAb verrà incubato con 10e6 cellule in un volume di 100 microL. Anticorpi isotipici irrilevanti saranno utlizzati come controlli negativi. Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente le cellule verranno lavate 3 volte in PBS addizionata con azide 0.2% ed albumina 0.2%, ed analizzate mediante un citofluorimetro FacsCalibur dual-laser (Becton Dickinson). Saranno acquisiti, per ciascun campione, un minimo di 10.000 eventi utilizzando un "live-gate" disegnato sulle caratteristiche di scatter dei blasti (per i campioni patologici), o dei progenitori normali (donatori sani). I dati relativi alle acquisizioni descritte saranno quindi analizzati mediante il software Cellquest (Becton Dickinson). I parametri considerati nel corso della analisi saranno i seguenti: 1) la percentuale di positività per ciascun antigene, calcolata comparando il campione marcato con il MoAb rilevante con il relativo campione negativo di controllo; 2) il valore della intensità media di fluorescenza (IMF) per ciascuna antigene, ottenuto dividendo la IMF del campione in esame per quella del campione negativo di controllo; 3) un indice per ciascun antigene definito dal prodotto della percentuale di positività per il valore di IMF; 4) per quegli antigeni che presentino un trend di espressione mutualmente esclusivo, sarà possibile creare un "ratio" dato dal rapporto del loro indice. Questo potrebbe risultare utile poiché è verosimile che, come già dimostrato dal nostro gruppo in dati preliminari, determinati antigeni mostrino la capacità di influenzarsi l'un l'altro nelle loro modalità di espressione. Il test per l'espressione di annessina V e ioduro di propidio (PI) verrà eseguito secondo i test commercializzati da Pharmingen. L'annessina V è una fosfatidilserina che viene traslocata dal versante citoplasmatico al versante esterno della membrana cellulare nelle prime fasi dell'apoptosi; la rilevazione di tale molecola consente di misurare l'apoptosi ancor prima della frammentazione del DNA. Lo ioduro di Propidio è un colorante vitale che si lega al DNA, ma è in grado di penetrare all'interno della cellula solo in presenza di perdita di integrità della membrana. Di conseguenza non colora le cellule vitali o nelle prime fasi dell'apoptosi (che sono positive per l'Annessina V) mentre colora le cellule morte o in fase di avanzata apoptosi.
