RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Sindromi Mielodisplastiche: modelli patogenetici e nuove possibilità terapeutiche

Università di riferimento

Università degli Studi di FIRENZE - AREA CRITICA MEDICO-CHIRURGICA - FIRENZE(FI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Valeria SANTINI

Descrizione

1) Determinare l'attività di 4 differenti inibitori delle HDAC sull'istone H2A e B, H3, H4 nelle cellule primarie CD34 positive derivate da sindromi mielodisplastiche confrontata a quella dei normali progenitori cellulari.
E' importante stabilire se gli effetti acetilanti degli HDACi siano generali o specifici per residui istonici e per particolari tipi di istoni localizzati in regioni di specifici promotori genici. Cellule derivate da midollo osseo normale saranno ottenute dopo consenso informato e saranno separate le cellule CD34 positive. Cellule primarie saranno ottenute dopo consenso informato da pazienti affetti da sindrome mielodisplastica (MDS) ad alto rischio (AREB, AREB-t) ammessi nelle nostre istituzioni. Le cellule così separate saranno coltivate in sospensione in RPMI 1640 10%FCS, con o senza fattori di crescita e in presenza e in assenza dei vari HDACinibitori. Sarà effettuata una curva dose risposta sia per la inibizione della proliferazione che per la induzione della acetiilazione istonica (WB). Una risposta temporale sarà inoltre effettuata ( 6, 24, 72 and 96 ore)in quanto essenziale per verificare il ruolo, la potenza e la specificità dei vari HDACi. Naturalmente siamo più interessati alla modulazione delle HDAC di classe I e II , dal momento che non è chiaro il ruolo di HDAC di classe III nelle cellule di mammiferi e dal momento che non sembrano risentire di alcuno degli HDACi conosciuti. Impiegheremo HDACi appartenenti solo a 4 classi di quelle conosciute, a dose scalari come di seguito riporatato:

Short chain fatty acids: valproic acid 1 to 5 mM and a xylitol butyrate ester derivative (D1) 0.1 to 1.5 mM
Hydroxamic acid derivatives: SAHA 1 to 50 microM
Benzamides: MS-275 (at present waiting for supply by Shering) 0.3 -3microM
Epoxyketones: trapoxine 50-250 nM

In questo nostro studio non saranno inclusi HDACi appartenenti alla classe dei peptidi ciclici (depsipeptide) e alle molecole ibride di nuova sintesi (CHAP 31 and 50).
L'interesse principale è focalizzato sulle HDAc di classe II in quanto coinvolte direttamente nella maturazione cellulare.

In tal maniera, una sorta di "HDACi screening" sarà eseguito nelle stesse condizioni sperimentali. Le colture saranno esaminate dopo varie ore di esposizione agli agenti farmacologici e saranno effettuati lisati cellulari totali. Dopo elettroforesi su SDS page, sarà effettuato Western Blotting per determinare le seguenti modificazioni degli istoni: acetilazione dell'istone H3, metilazione della lisina 4 di H3 associate entrambe con la trascrizione genica e la metilazione delle lisine 9 e 27, associate con il silenziamento genico.Acetilazione di H4 e metilazione della lisina 20 di H4. Fosforilazione della serina dell'istone H2B, apparentemente legata alla apoptosi. Le funzioni biologiche e il significato dei residui sopra menzionati devono essere completamente chiariti nelle cellule mielodiisplastiche. Abbiamo dimostrato che i derivati del butirrato sono efficaci nel reindurre l'acetilazione dell'istone H4, ma non nell'indurre acetilazione dell'istone H3 sopra i livelli basali; questa osservazione può portare alla conclusione che l'acetilazione non è la modificazione cruciale de-reprimente la trascrizione genica in H3. Evidenze preliminari mostrano che, in cellule umane trasformate, la metilazione della lisina 9 dell'istone H3 sembra essere il principale evento che determina la trascrizione genica. Attualmente non ci sono dati disponibili sugli effetti di HDACi sulla metilazione istonica, anche se si ipotizza che la sola combinazione di HDACi con agenti ipometilanti possa portare ad una significativa modificazione a questo livello. Comunque, un differente assemblamento degli istoni, indotto dagli HDACi, potrebbe essere critico per rendere la cromatina accessibile per la metilazione istonica. Interazioni molecolari dirette tra HDAC e DNMT sono stati dimostrate in cellule PML/RARalfa positive e supposto nelle cellule AML1/ETO positive, mentre nelle LAM in cui il gene MLL è alterato, l'istone metiltransferasi è deleta.
Dal momento che la metilazione istonica è associata in maniera differenziale alla metilazione delle isole CpG ed in generale allo stato di metilazione del DNA, effettueremo anche esperimenti in cui 5-azacytidine and decitabine alle dosi scalari di 1-5 microM and 0.1-2.5 microM saranno combinate ai diversi HDACi.
In breve , le cellule saranno esposte a bassissime dosi di DNMTi ed ins seguito incubate con HDACi (vedi sopra).
Il DNA cellulare sarà estratto e modificato con il metodo al bisulfito, verrà effettuata poi PCR specifica per i geni di p15, p16, e-cadherin e inoltre verrà eseguito DNA methylation assay, combinato a bisulfite restriction analysis (COBRA) . La maturazione verrà studiata con immunofenotipo ( espressione di CD11b, CD15, CD14 ) , mentre l'apoptosi verrà determinata con attivazione di caspasi e esposizione di annessina V in superficie. I test proliferativi come WST-1 o equivalenti verranno impiegati per verificare la crescita cellulare.


2) Mappatura di espressione proteica differenziale nelle mielodisplasie con identificazione di sottogruppi clinici/proteici. Confronto con cellule CD 34 positive midollari normali
Gli estratti proteici cellulari totali verranno separati mediante elettroforesi bidimensionale (2DE), con isoelectrofocusing come prima dimensione separativa (le proteine vengono separate in base al loro punto isoelettrico), e SDS PAGE come seconda dimensione (le proteine si separano secondo la loro massa molecolare). La strumentazione è disponibile presso il nostro laboratorio di Ematologia, Università di Firenze.
Le spot proteiche visualizzate dalla procedura di staining saranno digerite con una proteasi specifica e i peptidi risultanti verranno analizzati con Spettrometria di Massa MALDI TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time of Flight), attraverso la procedura di Peptide Mass Fingerprinting (PMF) e/o con esperimenti confermativi di frammentazione (MS/MS) per l'identificazione proteica (strumentazione disponibile presso il CISM, Università di Firenze). La ricerca in banca dati verrà effettuata col software MASCOT (www.matrixscience.com).
I pattern proteici di MDS e cellule normali verranno confrontati con e senza il trattamento con diversi HDACi e DNMTi mediante la sovrapposizione e l'allineamento delle relative mappe bidimensionali. I gel bidimensionali ottenuti verranno infatti digitalizzati , e le immagini acquisite confrontate con un software dedicato al fine di stabilire: i) gruppi di proteine caratteristici ii) proteine comuni con un diverso livello di espressione.
Inoltre l'analisi proteomica sarà indirizzata all'osservazione di modificazioni post traduzionali per le proteine identificate, con particolare riguardo al grado di acetilazione pre- e post- trattamento con HDACi e DNMTi, sia per gli istoni che per le proteine non istoniche (circa 200).
Sarà importante verificare la modulazione della espressione proteica in mielodisplasie sottoposte a trattamento in vitro (e possibilmente in vivo) con farmaci interferenti con meccanismi epigenetici (inibitori delle istone deacetilasi o DNMTinibitori) , per caratterizzare il meccanismi molecolare della risposta a tali farmaci e possibilmente identificare dei biomarkers predittivi di risposta clinica.



3) Evidenziare una possibile riespressione di geni silenziati dopo il trattamento delle cellule con HDACi, e la soppressione di geni promuoventi l'apoptosi, la proliferazione e la resistenza a farmaci.
Il confronto tra pattern di espressione genica nelle cellule CD34 positive di MDS e progenitori normali sarà condotto con e senza inibitori di HDAC e farmaci ipometilanti. Lo schema del trattamento cellulare con questi agenti sarà esattamente come sopra menzionato. Una real-time PCR quantitativa con metodo Sybr Green sarà applicata come conferma dei dati ottenuti mediante microarrays del cDNA, ma anche per discriminare gli effetti sui geni di particolare interesse come markers di trasformazione. Il gene suppressor del tumore di Wilms (WT1) è uno di questi geni. E' iperespresso in un alto numero di neoplasie ematologiche. Anche se attualmente il significato biologico della espressione di WT1 è ancora non chiaro, questo marker potrebbe rappresentare un utile mezzo di monitoraggio molecolare della influenza di HDAC sulle modificazioni epigenetiche delle cellule mielodisplastiche. Più generalmente, il profilo genetico di diversi sottogruppi di MDS sarà valutata prima e dopo l'esposizione ad HDACi e ad agenti ipometilanti mediante l'uso di microarrays ad oligonucleotidi ad alta densità. Il bersaglio di cRNA è preparato da RNA cellulare totale, ibridizzato agli oligonucleotidi HuGeneFL Affymetrix, scannerizzati ed analizzati in accordo ai protocolli Affymetrix. Riteniamo che una selezione di 100 geni circa ci consenta già di effettuare delle analisi interessanti. Il sistema è disponibile alla nostra Università come servizio. Nei nostri modelli l'espressione dei geni è correlata alla loro posizione sul genoma. Fenomeni epigenetici possono anche silenziare diversi geni nella stessa regione del cromosoma. Recentemente alcuni autori hanno proposto un metodo che utilizza il legame dalla informazione della espressione ottenuta dal DNA ad alta densità al locus del gene accordato ai correnti database. Metodi statistici adeguati per individuare numerose corse di geni non espressi possono essere introdotti e confrontati a qualsiasi altro per il merito della loro efficacia contro i falsi positivi. Il nostro principale interesse è focalizzare i geni coinvolti nella apoptosi, nella maturazione granulocitaria e nella resistenza ai farmaci.

4) Analisi della trasduzione del segnale in cellule CD 34 pos di MDS trattate con HDACi.
L'attività biologica di HDACi è molto probabilmente non limitata alla acetilazione degli istoni. Le differenti molecole di HDACi condividono anche vari effetti sulle vie della traduzione del segnale. Noi abbiamo avuto dimostrato che i butirrati attivano ERK-MAPK e vorremmo completare questo studio con l'aggiunta di specifici inibitori di MEK/ERK/JNK. L'attivazione delle chinasi Lyn, Syk, Hck, e Shc e le fosfatasi saranno valutate come dato basale e dopo un breve (10 min-1 ora) e lungo (24 ore) tempo di esposizione alle varie molecole di HDACi, con le concentrazioni sopra riportate . Saranno effettuati anche Western Blotting e IP da lisati cellulari. Recentemente è stata descritto che il fattore nucleare KB (NF-kB) ha un'attività trascrittiva incrementata nei blasti di pazienti affetti da leucemia acuta e mielodisplasia. Alcuni nostri dati attualmente preliminari ottenuti in vitro utilizzando l'acido valproico , noto per la sua attività inibitoria sull'0istone deacetilasi, suggeriscono una down-modulazione dell'attività di binding di NF-kB nelle cellule primarie in linee cellulari di LAM.

5) Verificare gli effetti dei diversi HDACi sulla riespressione dei geni controllati dal fattore di trascrizione al quale HDAC è legato.
Modificazioni epigenetiche degli istoni sono locali ed hanno impatto sulla espressione si geni specifici situati vicino al sito di rimodellamento cromatinico. Effettueremo una immunoprecipitazione cromatinica (ChIP). Avendo pubblicato dati sulla acetilazione dell'istone H4, ci focalizzeremo sul ChIP dell'istone H4 acetilato. La metodica del ChIP sarà effettuato seguendo i protocolli proposti da Kuo e Allis (11). Brevemente, le cellule derivate da MDS saranno purificate ed esposte agli HDACi come specificato sopra. I pellets cellulari saranno trattati per un cross-linking e posti in buffer ipotonico per rilasciare le proteine citoplasmatiche. I pellets nucleari saranno quindi lisati e sonicati. La cromatina ottenuta chimicamente dal cross-linking e frammentata sarà precipitata con anticorpi contro l'istone H4 acetilato cosi come con una IgG di controllo. La presenza dei promotori MPO, IL-3, GM-CSF, G-CSF-R, M-CSF-R con quei precipitati finali saranno esaminati mediante amplificazione in PCR con primers specifici. La PCR sarà effettuata anche per fattori trascrizionali regolanti la maturazione emopoietica: cEBPalfa ed ipsilon, PU.1 e GATA.1. Nel corso degli esperimenti potremmo valutare se effettuare il ChIP per il residuo metilato della lisina 4 di H3.