RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Sindromi Mielodisplastiche: modelli patogenetici e nuove possibilità terapeutiche

Università di riferimento

Università degli Studi di BOLOGNA - UCI - CARDIOLOGIA ED EMATOLOGIA - BOLOGNA(BO)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Nicoletta TESTONI

Descrizione

Il presente progetto si caratterizza su alcuni obiettivi principali e verrà svolto in fasi:
Fase 1.
Il primo di questi obiettivi è la caratterizzazione della SMD con coinvolgimento delle regioni cromosomiche 3q21 e 3q26. Recentemente abbiamo evidenziato in pazienti con t(3;3)(q21;q26) o inv (3)(q21q26) la presenza del trascritto di fusione RPN1-Evi1. L'espressione inappropriata di Evi1, che si osserva in questi pazienti può essere dovuta alla giustapposizione di Evi1 alla regione prossimale del promotore di RPN1. Inoltre la banda 3q21 è coinvolta anche in altre traslocazioni, come recentemente riportato la t(1;3)(p36;q21) in cui si ha il gene di fusione MEL1-RPN1. Anche in questo caso si ha la overespressione di MEL1, gene presente esclusivamente nelle cellule leucemiche con t(1;3). Occorre ricordare che a livello della banda 3q21 sono stati evidenziati altri geni, quali EAP, GR6 e GATA2 che potrebbero essere interessati da questi riarrangiamenti cromosomici. Pedarski et al. hanno riportato la formazione di un gene di fusione GR6-Evi1. GATA2 è un gene che regola gli eventi precoci dello sviluppo emopoietico ed è necessario per la proliferazione dei progenitori staminali non commissionati; la sua espressione viene down-regolata durante la maturazione emopoietica; la sua over-espressione ectopica promuove la proliferazione a spese della differenziazione.
L'espressione aberrante di RPN1-Evi1 (e quella degli altri geni sopra menzionati) sarà studiata mediante:
a) Citogenetica convenzionale e ibridazione in situ fluorescente (FISH) per identificare casi con alterazioni 3q21 e/o 3q26;
b) RT-PCR qualitativa e quantitativa mediante real time. Questa metodica permette una duplice quantificazione: assoluta e relativa (amplificazione di un gene di controllo, indipendente dalla fase del ciclo cellulare, costitutivamente espresso e indipendente dalle fasi della malattia). Il nostro laboratorio aderisce al progetto Europeo di standardizzazione della quantificazione dei trascritti associati a leucemie e SMD (http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/mrd_leukemia e Leukemia net) che comprende lo studio di Evi1.
c) Microarray (o gene chips): questa tecnica permette di studiare contemporaneamente l'espressione di migliaia di geni nella cellula tra cui RPN1, EAP, GATA2 e GR6. Se sarà possibile sospettare con microarray nuovi trascritti di fusione, questi verranno ricercati con metodiche di Southern blot e clonati successivamente mediante RACE-PCR.
Il secondo obiettivo di questo progetto sarà lo studio del ruolo della espressione di Evi1 ed di altri fattori trascrizionali nella trasformazione leucemica delle SMD in rapporto alla esposizione in vitro a diversi farmaci. È stato riportato che Evi1 e Mds1-Evi1 sono indotti in alcune linee umane mediante acido retinoico e questa induzione è indipendente dalla sintesi proteica e non è dovuta alla stabilizzazione di mRNA. Questo fa ipotizzare la presenza nel promotore di Evi1 di un elemento responsivo a acido all-trans retinico (RARE). Per verificare questa ipotesi intendiamo valutare mediante microarray cellule blastiche prima e dopo coltura in vitro con ATRA per valutare quali geni vengano coinvolti. Abbiamo ricordato come Evi1 sia un potente repressore trascrizionale mentre Mds1-Evi1 sia un attivatore trascrizionale attivo nelle cellule normali. Poche informazioni sono disponibili sui geni regolati da Evi1 e Mds1-Evi1 che saranno indagati mediante microarray.
Intendiamo indagare, inoltre, l'attivita' trascrizionale indotta da farmaci con attivita' istone deacetilasica (HDAC)inibitoria su linee e cellule con espressione di Evi1. L'azione di Evi1 sembra si esplichi mediante l'associazione con l'istone deacetilasi; l'attività deacetilasica è fondamentale nella regolazione genica in quanto regola l'accessibilità dei complessi trascrizionali e co-repressionali della trascrizione genica. Pertanto l'HDAC è coinvolta nel controllo della proliferazione e della differenziazione cellulare. Utilizzando inibitori dell'istone deacetilasi come la Tricostatina A (TSA), (che è tossica in vivo), ma anche LAQ804, FK228, MS 27-275, Pivanex oppure ac. Valproico, si dovrebbe assistere alla de-repressione trascrizionale dei geni target. Verranno analizzati, mediante microarray, sia linee cellulari che esprimono Evi1 in maniera costitutiva che cellule blastiche di pazienti prima e dopo esposizione a TSA. Si vuole anche analizzare, mediante l'utilizzo di linee cellulari, come K562, MK1, ecc, e di blasti leucemici l'azione di TSA su Evi1, proliferazione, differenziazione e apoptosi.
Fase 2.
Un obiettivo di ricerca parallelo verterà sulla caratterizzazione del rapporto Evi1 e megacariocitopoiesi. Nonostante alterazioni della megacariocitopoiesi non siano sistematicamente osservate in tutti i pazienti con alterazioni citogenetiche a livello delle bande 3q21 e/o 3q26, la frequenza di pazienti con queste caratteristiche supporta l'ipotesi di una correlazione fra queste alterazioni cromosomiche e l'espressione anormale del gene Evi1. La forzata espressione di Evi1 determina un numero estremamente alto di colonie megacariocitarie nelle cellule staminali embrioniche murine. Molti fattori trascrizionali sono stati implicati nella megacariocitopoiesi e sono correlati ad Evi1; tra questi ricordiamo SCL/TAL1, c-myb, membri della famiglia Ets, GATA-1, FOG, TGF-beta e NF-E2. Mediante microarray, ci proponiamo di studiare quali sono i geni deregolati da una espressione perturbata di Evi1 sulla megacariocitopoiesi: a) valutare l'espressione di Evi1 in linee cellulari megacarioblastiche (MK1, MK2, B1647, M07e); b) valutare quantitativamente l'espressione di Evi1 mediante Real-Time RT-PCR in megacariociti normali e di pazienti con alterazioni 3q21 e/o 3q26 sindrome.
Fase 3.
Per quanto riguarda l'attivita' trascrizionale indotta da farmaci con attivita' metiltransferasica su linee e cellule con espressione di Evi1,intendiamo studiare profili di espressione genica, prima e dopo esposizione di blasti leucemici con farmaci ad azione "metiltransferasi" inibitoria quali 5-Aza-cytidine (Pharmion) e Decitabine (SuperGen). Per studiare il ruolo delle modificazioni epigenetiche del DNA verrà utilizzato il sistema del silenziamento genico post-trascrizionale" basato su molecole a doppio filamento di RNA, anche noto come RNA interference (RNAi): questo metodo è un'efficace strategia per sopprimere l'espressione di specifici geni rendendo possibile lo studio della funzione genica tanto in cellule in coltura quanto in vivo. L'RNAi sarà usato per indurre il silenziamento di enzimi coinvolti nell'epigenetica.
Fase 4.
Sarà analizzato il coinvolgimento delle tirosino-chinasi nell'eziopatogenesi e progressione delle SMD. Alcune SMD dipendono nella loro eziopatogenesi dalla attivazione aberrante o mutata di proteine tirosino kinasi (TK) o coinvolte in pathways di TK: tra queste vi sono FLT3, VEGFR, ABL, DEK, CSF1R,CBL, HOXA9, N-ras, AKT, c-KIT, PKC, PDGFRa e PDGFRb. Sarà valutata mediante RT-PCR l'incidenza del coinvolgimento di alcuni di queste TK nelle MDS in particolare di PDGFR, di VEGFR, e di AKT.
Saranno ideati, coordinati e promossi studi pre-clinici in vitro e trials clinici con inibitori di PDGFRa e PDGFRb in MDS (imatinib e SKI606), con FTI (Zarnestra R115777 e SCH66336) in CML e MDS, con anti-VEGFR (AZD0530). In tal senso, abbiamo gia ottenuto il Material transfer agreement (MTA) per i farmaci e iniziato studi pre-clinici.
La reale fattibilità delle proposte del progetto è assicurata da:
1. Presenza di un' ampia casistica di pazienti affetti da SMD e inseriti nei protocolli terapeutici dell'Istituto Seràgnoli, provenienti dalla regione Emilia Romagna e da Istituti di cura Nazionali di cui routinariamente conserviamo materiale, sia di DNA, che di RNA, corrispondente alle varie fasi della malattia e del trattamento terapeutico.
2. La competenza tecnica e scientifica da parte del personale del gruppo di ricerca.
3. La presenza nel nostro laboratorio della strumentazione necessaria alla finalità del progetto.