RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

La placenta quale sorgente di markers biofisici, biochimici e molecolari nelle patologie della gravidanza

Università di riferimento

Università Cattolica del Sacro Cuore - Clinica ostetrica e ginecologica - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Antonio LANZONE

Descrizione

Nella presente ricerca ci proponiamo di approfondire la possibile influenza di ET-1, ET-3, CRF e CoCl2 (ipossia chimica) sul sistema del VEGF nei due principali compartimenti cellulari placentari, quali il trofoblasto e le cellule endoteliali . In particolare, valuteremo in tali cellule l'effetto delle suddette sostanze sull'espressione genica e sulla produzione di VEGF-R1 e/o della sua forma solubile s-VEGFR1, quest'ultimo potente antagonista funzionale del VEGF.
Nelle cellule del trofoblasto studieremo, inoltre, l'effetto dei suddetti stimoli sull'espressione genica dell'EG-VEGF, fattore angiogenico solo di recente identificato potenzialmente coinvolto, al pari del VEGF, nella fisiologia e fisiopatologia placentare.
Analizzeremo successivamente l'espressione del ghrelin in cellule di trofoblasto da placente da gravidanze normali o con preeclampsia. In parallelo, colture di HUVEC saranno usate per lo studio dell'eventuale influenza di tale peptide sulla funzione e sulla proliferazione endoteliale. In particolare, in HUVEC trattate con ghrelin sarà valutata la produzione di PGF2alfa, PGE2 e PGI2, mediante dosaggio radioimmunologico (RIA), e l'espressione genica di NOS mediante reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Quest'ultima consentirà nelle stesse cellule di valutare anche l'espressione di PA e PAI-1. In ultimo si studierà l'eventuale effetto del ghrelin sulla sintesi di VEGF in HUVEC e cellule di trofoblasto e, in queste ultime, anche di EG-VEGF.
Colture primarie di cellule di trofoblasto
Si utilizzeranno placente ottenute da tagli cesarei elettivi (presentazione podalica, pregresso taglio cesareo, pregressa miomectomia) a termine di gravidanze fisiologiche. Per lo studio dell'espressione del ghrelin, alcuni esperimenti saranno condotti prelevando placente da gravidanze complicate da preeclampsia. Quest'ultimo quadro patologico sarà definito dalla presenza di ipertensione arteriosa (>140/90) in almeno due diverse rilevazioni e dalla presenza di proteinuria (>0.3 g/24h). Frammenti di tessuto placentare, prelevati escludendo le membrane amniocoriali, vengono sottoposti a ripetuti lavaggi con soluzione fisiologica al fine di rimuovere il sangue dagli spazi intervillosi. Si procede successivamente alla digestione enzimatica di tali frammenti tissutali mediante incubazione a 37 C per 10 min con dispase (15 g di tessuto in 15 ml di soluzione enzimatica). L'enzima viene successivamente inattivato con l'aggiunta di EDTA 0.5M. Il tessuto così digerito viene centrifugato, il sovranatante eliminato e il sedimento risospeso in terreno e mantenuto in ghiaccio per 20 min per far precipitare sul fondo i frammenti indigeriti, cosicché rimangano in sospensione le cellule di trofoblasto e i frammenti più piccoli, a loro volta eliminati filtrando la sospensione cellulare con mesh di nylon con pori di 100 micron. Tale procedura viene ripetuta due volte. Per purificare ulteriormente le cellule di trofoblasto si procede alla sedimentazione della sospensione cellulare in gradienti di Percoll a densità crescente (stratificazione successiva di soluzioni che contengono dal 45% al 15% di Percoll) centrifugata per 30 min a 2000 rpm. Per isolare in modo ancora più preciso le cellule di trofoblasto, il pellet così isolato verrà poi sottoposto ad ulteriore purificazione mediante immunoselezione negativa usando la tecnica delle micro-beats (Metodo Miltenyi). Le cellule finalmente isolate saranno risospese in terreno appropriato (DMEM) contenente siero fetale bovino al 10%. Dopo la conta, le cellule saranno seminate alla concentrazione di 1000000 cellule/ml e incubate a 37 C con le sostanze da testare in un'atmosfera costituita dal 95% di aria e 5% di CO2. Al termine dell'incubazione il terreno di coltura sarà raccolto e conservato a -20C fino al dosaggio Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) di sVEGFR-1 mediante apposito kit commerciale. Le cellule, invece, verranno sottoposte al processo di estrazione dell'RNA totale per la RT-PCR.
Colture primarie di HUVEC
Si utilizzeranno funicoli ottenuti da tagli cesarei elettivi (presentazione podalica, pregresso taglio cesareo, pregressa miomectomia) a termine di gravidanze fisiologiche. Appena prelevato, il cordone viene immerso in soluzione salina sterile e subito sottoposto al processo di isolamento delle HUVEC. La vena ombelicale viene incannulata alle due estremità e perfuso con soluzione fisiologica sterile per eliminare i residui ematici. Previa chiusura di una delle due estremità, la vena viene riempita di una soluzione enzimatica costituita da collagenasi tipo IA allo 0.03% in HBSS (senza calcio e magnesio). Il cordone viene, così, incubato per 10 min a 37C. Al termine dell'incubazione la vena viene perfusa con 40 ml di HBSS. La soluzione contenente le cellule endoteliali in sospensione viene, quindi, raccolta in un tubo di polipropilene da 50 ml e centrifugata a 4 C per 10 min a 1300rpm. Eliminato il sovranatante, il pellet viene risospeso in Medium 199, contenente il 10% di siero fetale bovino inattivato, antibiotici, endothelial growth factor e eparina (terreno "completo"). La sospensione cellulare viene, quindi, incubata in una flask T25. Raggiunta la confluenza, le cellule vengono staccate con una soluzione di tripsina-EDTA e amplificate con un rapporto 1:3, seminandole in una flask T75. Raggiunta nuovamente la confluenza le HUVEC vengono staccate, riseminate alla concentrazione di 75000 cellule/ml in piastre da 48 pozzetti o flask T25. Dopo 24h di preincubazione con terreno "completo", si procede allo stimolo che viene eseguito con le sostanze da testare disciolte in Medium 199 privo di siero e fattori di crescita. Le cellule così trattate vengono quindi incubate a 37C al 95% di aria e 5% di CO2. Al termine dell'incubazione il terreno viene raccolto e conservato a -20C fino al momento del dosaggio RIA delle PGs e del dosaggio ELISA del sVEGFR-1 mediante apposito kit commerciale. Le cellule, invece, verranno sottoposte al processo di estrazione dell'RNA totale per la RT-PCR.
Studio della proliferazione endoteliale
Per la quantificazione della proliferazione cellulare le HUVEC vengono piastrate in piastre da 96 pozzetti e incubate con terreno privo di siero (controllo) o con concentrazioni crescenti di Ghrelin per 24 o 48h. La prolattina (PRL) 25 ng/ml viene usata come stimolo positivo di proliferazione per le HUVEC. Successivamente per la quantificazione della proliferazione cellulare si esegue un dosaggio ELISA, mediante apposito kit commerciale, basato sulla misura dell'incorporazione della Bromo-deossi-Uridina (BrdU) durante la sintesi del DNA. In particolare, dopo l'incubazione delle cellule con le suddette sostanze, la BrdU viene aggiunta nei pozzetti e le HUVEC vengono reincubate per altre 6 h. Durante tale periodo di tempo la BrdU viene incorporata al posto della timidina nel DNA delle cellule in proliferazione. Dopo aver rimosso il terreno di coltura, le cellule vengono fissate e il DNA viene denaturato. Un anticorpo monoclonale coniugato con la perossidasi lega la BrdU incorporata nel DNA cellulare di nuova sintesi. Tale complesso immune viene quantificato misurandone l'assorbanza all'appropriata lunghezza d'onda mediante apposito spettrofotometro (lettore ELISA). I valori di assorbanza sono direttamente correlati alla quantità del DNA di nuova sintesi e, quindi, al numero delle cellule in proliferazione nei singoli pozzetti.
Dosaggio delle prostaglandine
La 6-ketoPGF1alfa, stabile metabolita della prostaciclina, la PGE2 e la PGF2alfa verranno dosate nel terreno di coltura con metodo radioimmunologico. Si prepara una miscela di 1.5 ml contenente 50microl di terreno di incubazione, 200microl di tampone fosfato 0.025M, 6-ketoPGF1alfa o PGE2 o PGF2alfa tritiate (2500-3500 cpm) e un'appropriata diluizione dell'apposito anticorpo. Per ciascun dosaggio si prepara una curva standard in duplicato con range variabile seconda della prostaglandina analizzata. I tubi di dosaggio vengono incubati per 24h. Dopo la separazione con charcoal dei prostanoidi legati all'anticorpo, i tubi vengono centrifugati e il sovranatante decantato in 10 ml di liquido di scintillazione per misurarne la radioattività.
Estrazione e quantificazione dell' RNA totale
Le cellule destinate all'analisi di RT-PCR vengono omogeneizzate con TRIzol e sottoposte all'estrazione dell' RNA, la cui purezza e concentrazione vengono determinate con tecniche spettrofotometriche.
RT-PCR semiquantitativa
L'analisi di RT-PCR, a partire da 1 microg di RNA totale isolato, si effettua secondo le istruzioni della ditta fornitrice dei reagenti per le reazioni di retro-trascrizione e di amplificazione. L'impiego di specifici primer consente la valutazione dell'espressione di VEGFR-1, EG-VEGF, NOS, PA, PAI-1, che viene normalizzata mediante confronto con quella del gene costitutivo gliceraldeide-fosfo-deidrogenasi (GAPDH). L'identificazione dei prodotti di reazione avviene successivamente mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio in presenza di etidio-bromuro. L'intensità delle bande visualizzate viene determinata mediante densitometro con un sistema di acquisizione digitale di immagini.