RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Nuovi aspetti dell'infiammazione e del rimodellamento nelle patologie ostuttive delle vie aeree

Università di riferimento

Università degli Studi di GENOVA - MEDICINA INTERNA E SPECIALITA' MEDICHE - GENOVA(GE)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Giorgio Walter CANONICA

Descrizione

L'indagine svolta dalla nostra unità operativa ha i seguenti obiettivi:
verificare l'effetto di rimodellamento dell'acetilcolina, della bradichinina e del VEGF sul muscolo liscio bronchiale umano (MLB) immortalizzato in coltura, per mezzo di indagini isto-chimiche, biochimiche e funzionali con magnetic twisting citometry (MTC). Con tale metodologia è possibile quantificare variazioni della contrattilità delle cellule MLB nelle differenti condizioni di coltura.
In collaborazione con Rovati: testare l'effetto desensibilizzante sul recettore Beta-2-Gs dei leucotrieni e trombossani sia in un modello bovino con aggiunta dei mediatori stessi, sia in un modello umano di sensibilizzazione passiva e stimolazione allergica con gli inibitori specifici dei leucotrieni e del trombossano.
In collaborazione con Vancheri: testare l'effetto desensibilizzante sul recettore Beta-2-Gs della bradichinina sia in un modello bovino con aggiunta del mediatore sia in un modello umano di sensibilizzazione passiva e stimolazione allergica con l'inibitore specifico.
In collaborazione con Papi: testare l'effetto dell'interferon gamma e lambda e del sovranatante di colture epiteliali infettate con rhinovirus sul rilascio di acetilcolina da tessuto tracheale bovino.
In collaborazione con Chetta: testare l'effetto del VEGF sulla sintesi di fibronectina da parte delle cellule MLB e l'effetto della presenza in coltura di VEGF sulla loro contrattilità.

A tal fine saranno utilizzati i seguenti metodi ed approntati i seguenti protocolli sperimentali


STUDI SU COLTURE CELLULARI: effetti dell'incubazione con acetilcolina, bradichinina e VEGF sulla contrattilità delle cellule muscolari bronchiali umane in coltura.

Metodi di coltura:
Gli esperimenti verranno condotti su una linea immortalizzata di cellule muscolari lisce umane derivate dalle vie aeree.
Le cellule verranno coltivate in terreno DMEM con aggiunta di 10% FBS, penicillina, streptomicina e G418 in incubatore ad atmosfera umidificata in presenza di 5% CO2 a 39° o 33° C al fine ottenere un fenotipo differenziato o primitivo rispettivamente (Zhou, L. et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003;169, 703-711).
L'avvenuta differenziazione verrà testata attraverso l'utilizzo di metodologie quantitative per l'espressione di vimentina e alfa-actina e valutando la proliferazione cellulare con l'utilizzo di 3H-Timidina (Ammit, A.J et al FASEB J. 2001; 15, 1212-1214.).

Metodi immunocitochimici:
Le cellule verranno coltivate come sopra descritto a 33° e 39° C senza (controllo) o con aggiunta di acetilcolina (10-4M –10-5M), bradichinina (10-5M 10-6M) o VEGF (5-10 ng/ml) (test) per 24, 48, 72 o 144 ore e al raggiungimento della confluenza verranno distaccate dal supporto di coltura mediante trattamento con tripsina 0.25%, contate, risospese in terreno e citocentrifugate su vetrino caricato elettrostaticamente.
I vetrini verranno fissati all'aria e idratati con tampone fosfato, dopodiché si procederà all'incubazione con l'anticorpo specifico opportunamente diluito (vimentina e alfa-SMA) in camera umida a temperatura ambiente. Dopo diversi lavaggi in tampone fosfato i vetrini verranno incubati con Envision Peroxidase con la stessa modalità adottata per l'anticorpo primario e dopo incubazione a temperatura ambiente sottoposti a lavaggi con tampone fosfato.
Si effettuerà quindi una incubazione con diamino -benzidina controllando al microscopio l'intensità della colorazione per un massimo di 10 minuti. I vetrini verranno poi contrastati con Ematossilina di Mayer, risciacquati con H2O corrente, disidratati in alcool e xilolo e montati con Eukitt.
Proliferazione cellulare:
Le cellule verranno coltivate con la metodologia sopra descritta a 33° o 39° C in piastre per colture cellulari da 96 pozzetti fino al raggiungimento della semi-confluenza, quando la loro crescita verrà arrestata dalla sostituzione del terreno di coltura con un terreno composto da HAM'S F12 senza aggiunta di FBS. I diversi pozzetti saranno incubati con diverse concentrazioni di acetilcolina (10-4M –10-5M), bradichinina (10-5M, 10-6M) o VEGF (5-10 ng/ml) (test) o saranno mantenuti senza aggiunta di mediatori (controllo) per 24, 48, 72, 144 ore.
Ogni pozzetto sarà quindi trattato con 1 microCi di 3H-Timidina per un tempo variabile da 15 a 18 ore. Il terreno di coltura verrà rimosso, le cellule recuperate e il loro grado di incorporazione di timidina misurato tramite Beta-counter.
La produzione di fibronectina nei sovranatanti di coltura sarà testata con metodo ELISA (Kucich U et al Arch Biochem Byophys 2000;374:313-324).

Metodi biochimici per la misurazione del contenuto di kinasi della catena leggera della miosina (MLCK):
Prima e dopo incubazione con i differenti mediatori , aliquote di cellule muscolari liscie umane saranno pesate su una bilancia di precisione e immediatamente poste in tampone di estrazione mantenuto a 0°. Dopo omogenizzazione per 30 secondi a 22500 rpm l'omogenato verrà centrifugato a 15000 x g per 10 min a 4°C. I campioni verranno quindi separati in pellet e surnatanti. Dalle frazioni dei surnatanti saranno estratte le proteine mescolando i surnatanti con un tampone SDS-PAGE 5X 1:4 (vol:vol), il tutto verrà riscaldato a 95°C per 5 min. La frazione del pellet verrà ulteriormente estratta in seguito a risospensione in soluzione tampone per SDS-PAGE e riscaldamento a 95°C per 12 minuti in agitazione. Queste frazioni saranno quindi mescolate e concentrate per centrifugazione a 3000 X g per 2 ore a temperatura ambiente. Il concentrato (>30kD) sarà raccolto e centrifugato a 500x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Il volume dei campioni così ottenuti sarà misurato e i campioni verranno utilizzati per l'SDS-PAGE. Al fine di determinare il peso molecolare di MLCK estratto dalle cellule, aliquote di marcatori ad ampio spettro premarcati o biotinilati saranno inclusi nei gel. Successivamente all'elettroforesi le proteine saranno trasferite su filtri di nitrocellulosa utilizzando un tampone di trasferimento. In seguito al trasferimento su filtro la sezione di nitrocellulosa contenente i marcatori di peso molecolare verrà colorata con blu di Coomassie e la mobilità elettroforetica sarà misurata. Il resto del filtro verrà sottoposto a marcatura con anticorpi monoclonali di topo anti MLCK seguita da secondo anticorpo contro il topo coniugato ad una fosfatasi alcalina polivalente. L'identificazione delle bande di MLCK sarà effettuata incubando il filtro di nitrocellulosa in una soluzione cromogena contenente 0,5% di 5-bromo4-chloro-3-indolyl-fosfato e 0.5% di nitroblu tetrazolium. Il contenuto di MLCK sarà semiquantificato attraverso una scannerizzazione densitometrica con un densitometro laser (Ammit AJ et al. Am J Resp Crit Care Med 2000;161: 257-263).

Misurazioni con citometria magnetica rotante.
Arrivate a confluenza le cellule saranno separate dal supporto di coltura tramite trattamento con tripsina, piastrate alla giusta densità in pozzetti precedentemente rivestiti (24h) con collagene tipo I, ed incubate con acetilcolina, bradichinina o VEGF (test) o saranno mantenute senza aggiunta di mediatori (controllo) per 24, 48, 72, 144 ore.
Allo scadere dei diversi tempi di incubazione ai pozzetti contenenti le cellule saranno aggiunte un ugual numero di biglie ferromagnetiche (4.5 microm di diametro) presentanti, sulla loro superficie, il peptide Arg-Gly-Asp specifico per l'integrina (Fabry, B.,et al J. Appl. Physiol.2001; 91, 986-994). Dopo un tempo sufficiente a consentire il legame delle sferule ferromagnetiche l'imposizione di un campo elettromagnetico ne causerà l'allineamento. La contrattilità e la rigidità delle cellule sarà testata analizzando la risposta in torsione e deformazione a seguito di impulsi elettromagnetici perpendicolari alla direzione di allineamento delle microsferule magnetizzate. Apposito software dedicato piloterà gli elettromagneti e analizzerà le immagini ricavate da una camera digitale collegata ad un microscopio a inversione all'ingrandimento 10x per quantificare la torsione delle microsferule e la deformazione cellulare.
Alcuni esperimenti saranno condotti con combinazioni di Acetilcolina, Bradichinina, VEGF.

STUDI SU TESSUTO TRACHEALE BOVINO: 1) effetti dell' incubazione con interferon gamma e lambda sul rilascio di acetilcolina. 2) effetti del sovranatante di colture di cellule epiteliali infettate con rinovirus sul rilascio di acetilcolina da tessuto tracheale bovino.
Gli esperimenti saranno effettuati su strisce di muscolo tracheale bovino. Le strisce ottenute per dissezione saranno montate in due bagni termostatati a 37°C contenenti ciascuno 2 ml di soluzione fisiologica ossigenata. Ogni muscolo sarà posizionato all'interno del bagnetto, legandolo,da un capo, ad un elettrodo di platino vincolato ad un micromanipolatore a vite e dall'altro ad un altro elettrodo di platino montato all'estremità di un trasduttore di forza (LC 4001 GO120, Litra) collegato, a sua volta, ad un registratore su carta (Linseis L250 E, Selb Germany).
Ogni cameretta contenente il muscolo sarà connessa a due diversi circuiti idraulici intercambiabili, uno aperto, a volume variabile, ed uno chiuso a volume costante. Entrambi i circuiti conterranno soluzione fisiologica ossigenata ed il flusso al loro interno sarà regolato da una pompa peristaltica (Gilson Minipulse 3, Villiers Le Bel, France). Il circuito aperto sarà usato per mantenere i muscoli in soluzione di Krebs ossigenata e per procedere all'incubazione dei muscoli con leucotriene D4 o trombossanoA2 mentre il secondo sarà utilizzato per l'internalizzazione della colina triziata nel tessuto muscolare tracheale. In ogni esperimento un muscolo sarà utilizzato come controllo, mentre l'altro sarà utilizzato per testare i diversi farmaci (test).
Una volta montate le due strisce muscolari saranno stimolate elettricamente (25V, 25Hz, 0.5ms durata di ogni singolo stimolo, 0.01 ms ritardo tra due stimoli) ogni 5 minuti per 30 secondi, e allungate meccanicamente, tra due stimolazioni successive, fino a raggiungere una lunghezza di riferimento caratterizzata da un tono muscolare di circa 2 grammi. Le misurazioni che seguiranno saranno effettuate in condizioni isometriche.
Successivamente i due muscoli saranno incubati con 15 µCi di colina triziata (attività specifica = 75 Ci/mM) e saranno stimolati elettricamente per un periodo di 30 min per favorire la liberazione, la marcatura e il re-uptake di colina ed acetilcolina.
Al termine di questa fase i muscoli saranno incubati con hemicolinium-3 per bloccare il re-uptake di colina e lavati per 90 min circa con i soluzione fisiologica ossigenata in modo da allontanare, dal tessuto muscolare, l'eccesso di colina triziata. Di seguito avrà inizio, in contemporanea, la raccolta del superfusato dalle due camerette in apposite vials contenenti liquido di scintillazione (Ready Safe, Beckman Counter, Fullerton CA) al flusso di 1 ml/min. Le vials saranno numerate e sostituite ogni 3 min. Durante la raccolta i muscoli subiranno due stimolazioni elettriche di 3 min ciascuna e, tra la prima e la seconda stimolazione, la raccolta del superfusato verrà interrotta per 10 min per permettere l'incubazione (30 min) del muscolo test con interferon gamma o interferon lamba (1000 U/ml). La radioattività delle singole vials verrà successivamente valutata e quantificata tramite analisi con beta counter (LS 6500 multiporpose scintillation counter, Beckman Instruments).
Ogni vial sarà analizzata per 5 minuti per tre volte ed i risultati saranno espressi come disintegrazioni per minuto per grammo di tessuto (DPM/gr). I rilasci di acetilcolina marcata indotti da stimolazione elettrica saranno calcolati come le due aree comprese tra lo spontaneo rilascio di acetilcolina e i punti situati al di sopra di esso (A1, A2) e ad esse corrisponderanno due distinti valori di forza (F1, F2). Per valutare l'effetto dei farmaci sulla liberazione di acetilcolina e sulle risposte contrattili saranno calcolati i rapporti A2/A1 ed F2/F1 e confrontati con i rispettivi valori del controllo in assenza di farmaci. Per valutare le differenze statistiche tra i valori esaminati sarà utilizzato il t-test per dati appaiati. Analogo esperimento sarà effettuato utilizzando aliquote di sovranatante di colture di cellule epiteliali infettate da rinovirus (provenienza dal progetto Papi).

STUDI SU TESSUTO BRONCHIALE UMANO: 1) effetti desensibilizzanti di leucotrieni, trombossano e bradichinina sulla risposta del recettore Beta 2 al salbutamolo. 2) effetti desensibilizzanti della reazione allergica su tessuto bronchiale umano passivamente sensibilizzato e stimolato con allergene: azione preventiva di farmaci bloccanti l'azione di leucotrieni, trombossani e bradichinina.
Gli esperimenti saranno effettuati su anelli bronchiali umani provenienti da pazienti donatori non atopici operati per toracotomia nell'ospedale San Martino di Genova od ospedali limitrofi a seguito di patologie tumorali a carico dell'apparato respiratorio. Da ogni campione tissutale saranno ricavati 5 anelli bronchiali: un anello sarà utilizzato come controllo, due saranno incubati con Leucotriene D4 alle concentrazioni 10-5M e 10-6M rispettivamente, mentre i restanti due saranno incubati con trombossanoA2 alle concentrazioni 10-5M e 10-6M rispettivamente. In uno studio separato su altri 4 anelli bronchiali saranno testate tre concentrazioni di bradichinina (10-7M,10-6M,10-5M) mentre un anello sarà utilizzato come controllo. Le incubazioni con leucotriene D4, trombossano e bradichinina saranno effettuate per 1 ora a 37°C in soluzione fisiologica ossigenata. Al temine di queste incubazioni gli anelli saranno posizionati, tramite appositi ganci metallici, all'interno di bagnetti termostatati a 37°C contenenti soluzione fisiologica ossigenata, vincolandoli, da una parte ad un gancio metallico posto sul fondo del bagno, e dall'altro ad un trasduttore di forza connesso con un registratore su carta. Successivamente, ad intervalli regolari di 15 min, gli anelli saranno allungati fino all'ottenimento di una lunghezza di riferimento corrispondente ad una tensione di riposo dell'anello di circa un grammo. Gli anelli saranno in seguito contratti chimicamente con Carbacolo 10-6M e, raggiunta una fase di contrazione isometrica stabile, de-contratti con incrementi scalari di mezzo punto di scala logaritmica negativa in base 10 con Salbutamolo a partire dalla concentrazione 10-9M fino alla concentrazione di 10-4M.
Studi analoghi saranno eseguiti su anelli bronchiali umani sensibilizzati passivamente attraverso un'incubazione di 18 h a temperatura ambiente con siero prelevato da pazienti atopici verso gli allergeni maggiori degli acari della polvere(Song et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000;279(2):L209-15.). Al termine del processo di sensibilizzazione un anello sensibilizzato sarà tenuto come controllo, mentre due anelli saranno trattati con due concentrazioni di ciascun dei seguenti antagonisti: antagonisti recettoriali CysLT1, montelukast; antagonista dei recettori TP del trombossano, SQ29,548; antagonistì del recettore B1, desArg9[Leu8]BK, e del recettore B2, HOE-140BK della bradichinina. Successivamente si procederà all'incubazione di tutti gli anelli con estratto ricostituitoin soluzione di dermatofagoidi a 37°C per 1 h. Al termine di questi processi gli anelli saranno montati nei pozzetti termostatati contratti con Carbacolo e decontratti con Salbutamolo come descritto sopra.
Eventuali spostamenti delle curve dose riposta al Salbutamolo saranno valutati tramite analisi della varianza (ANOVA) per misure ripetute.