RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Nuovi aspetti dell'infiammazione e del rimodellamento nelle patologie ostuttive delle vie aeree

Università di riferimento

Università degli Studi di FERRARA - MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE - FERRARA(FE)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Alberto PAPI

Descrizione

Protocollo dello studio

Studi "in vitro"

Durante questa fase la linea cellulare epiteliale umana delle vie aeree BEAS-2 sarà infettata con il RV16 per:
· Verificare se in seguito all'infezione si virefica la produzione di IFNλs, l'andamento della produzione nel tempo e la risposta in funzione della dose di RV16 utilizzata. Inoltre verrà anche utilizzato RV16 inattivato mediate UV e altri sierotipi di RV (RV1b e RV9) per verificare se l'induzione di IFNλs richiede la replicazione attiva del virus e se la risposta è in funzione del recettore che il virus utilizza per infettare la cellula.
· Verificare se l'infezione con RV16 induce un'aumentata espressione dell'enzima colina acetiltransferasi deputato alla sintesi di acetilcolina
In fine le cellule BEAS-2B saranno trattate per 24 ore con IFNλ1 prima dell'infezione con RV16 per verificare se tale citochina sia in grado di indurre un effetto antivirale nei confronti del rinovirus stesso

Metodi

Cellule, RV16 e reagenti

Le cellule BEAS-2B, una linea cellulare epiteliale delle vie aeree umane, sarà coltivata in piastre da 12 pozzetti utilizzando il terreno di coltura DMEM arricchito con 10% di FBS a 37°C con 5% CO2 in aria umidificata. 1 105 cellule saranno seminate in ogni pozzetto e 24 ore prima dell'infezione con RV16, quando le cellule avranno raggiunto circa l'80% di confluenza, il terreno di coltura sarà cambiato con un terreno DMEM arricchito al 5% di FBS. Il Rv16 sarà generato e titolato utilizzando la linea cellulare HeLa come precedentemente descritto (Papi J Biol Chem 1999). Le cellule saranno infettate con una quantità di virus pari a 2 MOI. Le cellule saranno inoltre trattate con il solo terreno di coltura e con RV16 inattivato mediante UV come controlli negativi.
Sia la proteina ricombinante IFNλ1 che gli anticorpi policlonali per INFλ sono commercialmente disponibili (R&D System).
Specifici primers e sonde per IFNλ1, IFNλ2-3, RV16 e per colina acetiltransferasi saranno disegnati utilizzando il software Primer Express (Applied Biosystem) seguendo le indicazioni fornite dalla casa produttrice.
Una aliquota del supernatante del terreno di cultura (controllo e dopo infezione) verrà conservata in freezer a -80°C e successivamente inviata all'Unità di Genova (Prof. GW Canonica) per valutare gli effetti del medium così condizionato dalla infezione virale sul rilascio di acetilcolina da tessuto tracheale bovino, e per la ricerca di mediatori solubili.

TaqMan PCR
Una reazione polimerasica a catena (PCR) con metodica quantitativa (real-time quantitative fluorescent polymerase chain reaction – Taqman PCR) sarà utilizzata per testare l'aumentata sintesi di mRNA di IFNλ1, IFNλ2-3, e colina acetiltransferasi e per valutare la presenza di RNA virale per RV16. Tale procedure sarà effettuata grazie l'uso di "ABI 7700 sequence detector" (Applied Biosystem) secondo le linee guida fornite dal produttore. Una sequenza specifica del gene per IFNλ1, IFNλ2-3, e colina acetiltransferasi sarà clonato e diluito in modo tale da generare una curva standard.
L'estrazione e la purificazione dell'RNA dal lisato cellulare e la successiva reazione di trascrizione inversa saranno eseguite utilizzando ripettivamente il kit "RNasy Mini kit" ed il kit "Omniscript" entrambi forniti da Qiagen spa secondo le linee guida fornite dal produttore.
Metodiche per valutare l'effetto antivirale dell'IFNλ1
Le cellule BEAS-2B saranno trattate per 24 ore prima dell'infezione con dosi diverse di IFNλ1. L'effetto antivirale sarà valutato sia mediante metodica TaqMan PCR ricercando l'RNA virale nel lisato cellulare che mediante la titolazione in cellule HeLa del supernatante delle cellule BEAS-2B trattate ed infettate.

Metodica per valutare la produzione di IFNλs
Grazie all'utilizzo di due differenti tipi di anticorpi policlonali per IFNλs, la misurazione della concentrazione di IFNλs nel supernatante delle cellule BEAS-2B dopo l'infezione con RV16 sarà effettuato mediante un ELISA test con metodica a sandwich.

Modello "ex vivo":

In questa fase dello studio saranno raccolte mediante spazzolamento bronchiale cellule primarie epiteliali bronchiali (BECs) di pazienti asmatici e controlli normali. Colture in vitro delle BECs raccolte saranno infettate con RV16 e con RV16 inattivato mediante UV per verificare se l'infezione induce un'aumentata sintesi di IFNλs e colina acetiltransferasi; se negli asmatici si verifica una risposta antivirale deficitaria (misurata come carica virale aumentata e deficitaria produzione di IFNλs); ed in fine verificare se nelle BECs dei pazienti asmatici si verifica un'aumentata attivazione di colina acetiltransferasi rispetto ai normali giustificando così l'aumentata reattività bronchiale che si verifica nei pazienti asmatici in corso di infezione con RV16.

Metodi

Pazienti

Saranno reclutati nello studio 10 pazienti con asma bronchiale lieve persistente e 10 controlli sani. I pazienti asmatici (come da criteri di inclusione) saranno reclutati secondo le linee guida internazionali sulla diagnosi di asma (GINA 2002). I pazienti saranno sottoposti a broncoscopia e le cellule epiteliali bronchiali saranno raccolte mediante spazzolamento bronchiale. Lo studio sarà conforme alla Dichiarazione di Helsinki ed i pazienti firmeranno un consenso informato.

Criteri di inclusione

Pazienti asmatici di entrambi i sessi, di età compresa tra i 18-65 anni, con asma lieve persistente, in accordo con le recenti linee guida (GINA 2002), in fase di stabilità clinica. La valutazione della funzionalità respiratoria comprenderà la documentazione di una reversibilità del volume espiratorio massimale (VEMS) dopo inalazione di 200 mg di salbutamolo pari ad almeno il 15% del valore teorico prebroncodilatatore o di una iperresponsvità bronchiale alla metacolina inferiore a 4 mg/ml. Tutti i pazienti arruolati non dovranno essere in trattamento solo con b2 agonisti inalatori a breve durata di azione e non con glucocorticoidi per via inalatoria e/o sistemica, teofillina e/o antileucotrienici od altri farmaci antiasmatici da almeno 3 mesi.

Criteri di esclusione

1. Infezioni delle prime vie aeree nei 2 mesi precedenti
2. Fumatore in atto o pregresso da meno di 1 anno
3. Gravi patologie cardiache o neoplasie maligne concomitanti
4. Etilismo e tossicodipendenze
5. Gravidanza e allattamento.
6. Malattie psichiche gravi.
7. Recente (da meno di 2 mesi) riacutizzazione asmatica

Le cellule epiteliali bronchiali (BECs) saranno raccolte durante broncoscopia a fibre ottiche seguendo le linee guida standardizzate (Hurd J Allergy Clin Immunol 1991) e coltivate come precedentemente descritto (Bucchieri Am J Respir Cell Mol Biol 2001). Le cellule epiteliali bronchiali saranno seminate direttamente dopo spazzolamento bronchiale utilizzando un terreno di coltura arricchito con ormoni specifico per cellule epiteliali bronchiali (BEGM; Clonetics, San Diego, USA) contenente 50 U/ml di penicillina e 50mg/ml di streptomicina. Dopo 2 passaggi le cellule saranno seminate in una piastra con 12 pozzetti; al raggiungimento dell'80% di confluenza le cellule saranno infettate con RV16 per 8 ore. L'induzione di IFNλs e di colina acetiltransferasi sarà valutata mediante TaqMan PCR. L'ELISA con modalità sandwich sarà utilizzato per valutare la presenza di IFNλs nel supernatante. L'infettività del RV16 nelle cellule bronchiali di pazienti asmatici confrontato con l'infettività nei normali sarà valutata mediante la ricerca dell'RNA virale nel lisato cellulare allo scopo di verificare se l'infettività negli asmatici è maggiore.
Una aliquota del supernatante del terreno di cultura (controllo e dopo infezione) verrà conservata in freezer a -80°C e successivamente inviata all'Unità di Genova (Prof. GW Canonica) per valutare gli effetti del medium così condizionato dalla infezione virale sul rilascio di acetilcolina da tessuto tracheale bovino e per la ricerca di mediatori solubili. Si valuteranno altresì le eventuali differenze fra asmatici e controlli.