RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Nuovi aspetti dell'infiammazione e del rimodellamento nelle patologie ostuttive delle vie aeree

Università di riferimento

Università degli Studi di CATANIA - MEDICINA INTERNA E MEDICINA SPECIALISTICA - CATANIA(CT)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Carlo VANCHERI

Descrizione

Le linee cellulari di fibroblasti saranno stabilite utilizzando il metodo dell'outgrowth da biopsie bronchiali e da pezzi chirurgici secondo il metodo sviluppato da Jordana e collaboratori (ARDD 1988; 137; 579-584). In breve, le linee cellulari verranno ottenuti da aree istologicamente normali provenienti da biopsie o da pezzi chirurgici di pazienti sottoposti a tali procedure a causa di neoplasie polmonari. I campioni verranno ridotti in pezzi non più grandi di 1 mm3, lavati e quindi incubati in RPMI arricchito per 4 settimane. I pezzi verranno mantenuti aderenti alle piastre di polistirene grazie a dei vetrini coprioggetto sterili fissati con vaselina. Le linee di fibroblasti bronchiali verranno splittate 1/2 alla confluenza. Le cellule sub-coltivate verranno aliquotate e conservate in azoto liquido.
Utilizzeremo queste linee cellulari per studiare il ruolo specifico esercitato dalla BK nell'attivazione funzionale dei fibroblasti, e il suo possibile ruolo nel determinare la trasformazione degli stessi fibroblasti in miofibroblasti a livello cellulare e molecolare.
In particolare studieremo:
1- La espressione dei recettori della BK in colture di fibroblasti mediante citofluorimetria e RT-PCR. L'attività dei recettori della BK attualmente noti (B1 e B2) sarà valutata mediante l'uso dell'antagonista del recettore B1: Lys-(Des-Arg9, Leu8)–bradichinina e dell'antagonista del recettore B2: D-Arg,(Hyp3,Thi5,8,D-Phe7)–bradichinina.
2- Quale dei secondi messaggeri intracellulari è coinvolto nella trasduzione del segnale conseguente al legame della BK con i suoi recettori. Sarà valutata la via intracellulare attivata dalla BK. Un ruolo chiave potrebbe essere svolto dalle protein kinasi mitogeno-attivate (MAPKs), le quali operano attraverso cascate di fosforilazione responsabili della regolazione di molti substrati, la maggior parte dei quali sono fattori di trascrizione che regolano l'infiammazione, lo sviluppo embrionale, la proliferazione cellulare e l'apoptosi. Attualmente sono conosciuti 3 maggiori sottogruppi di MAPK, la c-Jun N-terminal chinasi (JNK), la p38 e la extracellular signal-regulated kinasi. Questi secondi messaggeri sono attivati da una doppia fosforilazione su un residuo di tirosina ed uno di treonina. Noi studieremo questi secondi messaggeri utilizzando gli anticorpi per immunoblotting anti-fosfo-p38, anti-fosfo-ERK 1/2 ed anti-fosfo-JNK, attualmente disponibili commercialmente.
3- Particolare attenzione sarà rivolta al profilo secretorio citochinico dei fibroblasti bronchiali. In particolare cercheremo di capire se la BK sia in grado di esercitare la sua attività direttamente o indirettamente in maniera autocrina attraverso la sintesi ed il rilascio di citochine, come ad esempio il TGF-beta, note per i loro effetti pro-fibrotici. Le citochine prodotte dai fibroblasti in risposta alla BK saranno studiate mediante l'impiego di kit ELISA disponibili commercialmente e mediante citofluorimetria attraverso la metodica di marcatura per le citochine intracellulari. Anticorpi monoclonali umani diretti contro le principali citochine pro-fibrotiche (es. TGF-beta, PDGF) saranno usati per capire se la BK agisce direttamente o indirettamente in una maniera autocrina attraverso l'azione delle citochine secrete dagli stessi fibroblasti quando stimolati dalla BK.
4-La produzione di VEGF sarà studiata in fibroblasti bronchiali stimolati con BK come precedentemente descritto. La COX-2 sarà studiata per accertare il grado di coinvolgimento dell'asse PGE-2/VEGF nell'attivazione dei fibroblasti indotta da BK.
5-L'evento centrale da studiare sarà il cambiamento fenotipico dei fibroblasti in miofibroblasti. Questo fenomeno sarà studiato investigando l'espressione dell'alfa-smooth actina, il marker principale dei miofibroblasti, mediante l'impiego di citofluorimetria, Western Blot e RT-PCR. Sarà studiata anche la miosina del muscolo liscio e la desmina. Sarà inoltre investigato il profilo delle metalloproteasi, i loro inibitori tissutali ed altre proteine secrete tipicamente dai miofibroblasti, così come quelle della famiglia del collagene. Tutti questi fenomeni saranno studiati sotto una varietà di stimoli (BK, TGF-beta, GM-CSF), agenti bloccanti (mh–ab–anti–TGF-beta, mh–ab–anti–GM-CSF), antagonisti dei recettori B1 e B2 della BK descritti prima e ifine inibitore specifico della MAPK-1 (PD98059) per analizzare il ruolo svolto dalla BK sui fibroblasti e miofibroblasti.
6- Proliferazione, ciclo cellulare e apoptosi di colture di fibroblasti bronchiali saranno studiati per comprendere i cambiamenti indotti dalla BK nell'attività metabolica di queste cellule usando la citofluorimetria ed il metodo dell'MTT.
7- L'adesione e la comunicazione intercellulare sono fenomeni essenziali al coordinamento dei processi di differenziazione tissutale e di rimodellamento. Le Gap Junction svolgono un ruolo fondamentale non solo nella propagazione dei segnali elettrici tra cellule eccitabili adiacenti, ma anche nel condurre dei segnali intercellulari durante lo sviluppo embrionale, nella regolazione della crescita e della differenziazione cellulare. Di grande interesse sarà quindi lo studio degli effetti mediati dalla BK sulla sintesi delle connessine, le proteine costituenti appunto le gap junctions, da parte di fibroblasti bronchiali. Sarà inoltre studiata la comunicazione intercellulare mediata dalle gap junctions. Infatti, queste giocano un ruolo importante nella rapida propagazione del segnale elettrico e nella sincronizzazione dell'attività metabolica. È stato ipotizzato che le connessine possano essere coinvolte nei processi di rimodellamento grazie alla loro capacità di regolare la proliferazione cellulare. Un difetto di comunicazione tra cellule adiacenti potrebbe causare delle alterazioni nei processi riparativi, portando i fibroblasti bronchiali a proliferare liberamente ed indipendentemente l'uno dall'altro. Infine, l'attività delle gap junctions può influire significativamente sulle proprietà contrattili delle colture di fibroblasti. Noi pensiamo che tutti questi fenomeni potrebbero giocare un importante ruolo nella trasformazione di fibroblasti in miofibroblasti e nei processi di rimodellamento. Studieremo quindi la comunicazione intercellulare gap junction mediata con la tecnica del dye transfer in citofluorimetria e mediante impiego della real time RT-PCR per quantificare l'espressione della CX 43, la connessina maggiormente espressa a livello dei fibroblasti polmonari umani.

MATERIALI E METODI
Analisi citofluorimetrica di molecole di superficie e intracellulari dei fibroblasti.
Per lo studio delle molecole di superficie, le cellule saranno incubate con anticorpi primari per 60 min a temperatura ambiente. Quinidi, un anticorpo secondario fluorescente, legato con FITC, sarà aggiunto per 60 min a t.a. La marcatura di molecole intracellulari seguirà un protocollo diverso. In breve, l'anticorpo primario e il secondario saranno veicolati attraverso la membrana cellulare grazie ad un buffer contenente saponina. Se necessario (ad esempio nello studio di citochine intracellulari) la brefeldina A sarà aggiunta alle colture di fibroblasti 6 ore prima della fissazione e della permeabilizzazione delle cellule. Dopo aver tripsinizzato e lavato accuratamente le cellule, queste verranno marcate con degli anticorpi monoclonali umani in buffer di saponina. I campioni di controllo saranno incubati con il solo anticorpo secondario. I campioni saranno analizzati usando un citofluorimetro Coulter Epics Elite ESP (Coulter Corporation, Miami, FL, USA). Saranno letti 10000 eventi in forward/side scatter per campione. Le cellule saranno eccitate a 488 nm e la fluorescenza sarà monitorata a 525 nm. La fluorescenza del FITC sarà raccolta usando un'amplificazione logaritmica.

Dosaggio delle citochine e di altri mediatori solubili.
La concentrazione di citochine e di altri mediatori solubili nel surnatante sarà determinata mediante dosaggi immunoenzimatici (ELISA) reperibili in commercio. Il contenuto intracellulare di citochine sarà valutato in citofluorimetria sui fibroblasti bronchiali come descritto prima. Per studiare quale particolare sottotipo di fibroblasti sia coinvolto nella produzione delle citochine indagate, sarà eseguita una doppia marcatura per valutare una particolare citochina congiuntamente ad un marker di attivazione dei fibroblasti, come l'actina alfa del muscolo liscio la COX-2.
Il contenuto di collagene delle colture di fibroblasti sarà determinato mediante il metodo del sirius red, utilizzando il kit Sircol Soluble Collagen Assay secondo le raccomandazioni del produttore.

Western blot
Le colture di fibroblasti stimolate in presenza o in assenza di specifici agenti bloccanti come il PD98059, uno specifico inibitore della MAPK/ERK kinase-1 (MEK-1), o anti-TGF-beta, saranno lisate in un buffer di lisi (un cocktail di EDTA, Triton x-100, fenilmetilsulfonilfluoruro e un inibitore delle proteasi). Dopo scraping delle cellule, un'aliquota sarà processata per determinarne la concentrazione di proteine secondo Bradford. L'elettroforesi sarà condotta in SDS-PAGE al 12% (40 mA/h) usando 60 g di proteine per pista. Dopo la separazione, le proteine saranno trasferite su una membrana di nitrocellulosa per 2 ore a temperatura ambiente usando una transblot semidry transfer cell. Dopo aver bloccato il processo, le membrane saranno incubate con anticorpi monoclonali murini diretti contro la actina alfa del muscolo liscio, miosina del muscolo liscio e la desmina per tutta la notte a 4°C. Le membrane saranno quindi incubate con anticorpo secondario coniugato a perossidasi. Le bande specifiche saranno visualizzate usando il sistema di rilevamento chemiluminescente SuperSignal.

Immunoblot
Dopo aver stimolato con BK le colture di fibroblasti verranno lisate per procedere al western blotting in un buffer per il saggio di radioimmunoprecipitazione. Le proteine estratte saranno separate mediante SDS-PAGE e trasferite su membrane PVDF. L'immunoblotting sarà eseguito utilizzando anticorpi monoclonali anti-fosfo-p38, anti-fosfo-ERK 1/2 ed anti-fosfo-JNK. Le membrane saranno quindi marcate nuovamente con anticorpi policlonali contro p38, ERK 1/2 e JNK totali (fosforilate e non fosforilate) gli anticorpi saranno visualizzati mediante chemiluminescenza e le bande sperimentali saranno analizzate un programma di densitometria computerizzata (Phoretix 1D versione 3.0).

Isolamento di RNA e RT-PCR
L'RNA cellulare totale sarà estratto con la procedura del guanidium isothiocyanate/acid-phenol come descritto precedentemente (15). La quantità raccolta e la purezza di RNA saranno misurate spettrofotometricamente con un assorbimento di 260/280 nm. L'RNA ottenuto verrà utilizzato per la generazione di cDNA. La reazione a catena della polimerasi e la trascrittasi inversa (RT-PCR) sarà messa a punto utilizzando un sistema di preamplificazione. Saranno usati primers specifici per ogni prodotto genico investigato. I prodotti amplificati dalla PCR verranno separati su gel di agarosio all'1,8% per elettroforesi, marcati con 0,5 g/ml di etidio bromuro e infine paragonati a dei marker di riferimento. I prodotti saranno visualizzati mediante illuminazione a raggi UV. Le fotografie dei gel saranno ottenute con apparecchiatura fotografica equipaggiata con pellicole Polaroid 665. Le bande saranno analizzate con il Phoretix 1D versione 3.0.

Distribuzione del ciclo cellulare
Per l'analisi del ciclo cellulare, le cellule verranno staccate e quindi fissate in etanolo al 70% per 1 ora a 4 C°, incubate con 20 µg/ml di RNase per 30 min a 37°C, marcate con 50 µg/ml di ioduro propidio per 10 min al buio e infine analizzate mediante citofluorimetria. Saranno acquisiti da 10.000 a 30.000 eventi per ogni campione. Saranno escluse le cellule con un contenuto subdiploide (<2n), perchè ritenute morte e solo gli eventi caratterizzati dai picchi in inferred gap 0 (G0)/gap 1 (G1), sintesi (S) e gap 2 + mitosi (G2 + M) saranno considerati. La proporzione delle cellule nella fase del ciclo cellulare G0/G1, S, and G2 + M saranno calcolate tramite il programma MODFIT LT TM.

Studio dell'apoptosi
Lo studio dell'apoptosi sarà effettuato mediante citofluorimetria dopo marcatura dei fibroblasti con annessina V-FITC e ioduro propidio. Le cellule in apoptosi precoce saranno definite come cellule positive solo per annessina V, le cellule necrotiche saranno definite come positive alla annessina V e allo ioduro propidio, le cellule negative per entrambi saranno considerate cellule vive.

Proliferazione cellulare
Le conte cellulare verranno eseguite mediante citofluorimetria utilizzando come riferimento un numero standard di fluorosfere (IL flow-count). Per valutare la proliferazione cellulare utilizzeremo il dosaggio colorimetrico al metiltiazolo tetrazolo (MTT), basato sulla conversione da parte della deidrogenasi mitocondriale del substrato contenente un anello di tetrazolo in formazano, rivelabile spettrofotometricamente. Il livello di formazano verrà utilizzato come un indice indiretto della densità cellulare. Brevemente, dopo trattamento con BK, le cellule saranno esposte all'MTT (5 g/ml) per 150 min a 37°C. Il medium verrà rimosso e le cellule solubilizzate con isopranolo acidificato e 2% sodio dodecil solfato. La quantità di formazano verrà valutata spettrofotometricamente con una lunghezza d'onda di riferimento di 650 nm.

Espressione e funzione delle gap junction dei fibroblasti
Sarà studiato l'effetto della bradichinina e dei precedentemente menzionati agenti bloccanti sulla espressione e sulla funzione delle gap junctions dei fibroblasti (connessina 43). Il grado di comunicazione fra fibroblasti sarà valutato mediante una tecnica di trasferimento itercellulare gap junctions specifico di colorante (Calceina). Le colture di fibroblasti, saranno marcate con Calceina (CAL) e DiI, un colorante che si lega alla membrana plasmatica indissolubilmente. Le cellule donatrici CAL+DiI+ saranno incubate con cellule autologhe riceventi CAL-DiI-. La comunicazione intercellulare gap junctions mediata sarà valutata grazie al trasferimento intercellulare di CAL dalle cellule donatrici alle cellule riceventi a 60 e 120 minuti. I risultati saranno espressi come incremento percentuale di cellule riceventi CAL+DiI- dopo la incubazione con cellule donatrici autologhe. L'espressione di CX43 sarà stimata mediante analisi in real time RT-PCR.

Analisi quantitativa in real time RT-PCR delle connessine.
L'RNA totale sarà estratto come descritto da Chomczynski e Sacchi (Chomczynski P, Sacchi N. Anal Biochem. 1987 Apr;162(1):156-9). La trascrizione inversa sarà eseguita usando l'RNA totale, Rnase H- trascrittasi inversa e primers di esameri random. Per gli esperimenti in real time PCR sarà utilizzato un ABI PRISM 7700 Sequence Detection System di Applied Biosystems. Verranno sintetizzate tre sequenze specifiche di oligonucleotidi per ogni mRNA usando il software Primer Express. Due di questi sono i primers forward (Fw) e reverse (Rv) usati per l'amplificazione della PCR. La terza sequenza è una sonda fluorogenica marcata con un colorante fluorescente (6-FAM, VIC) ed un quencher dye (TAMRA) attaccati rispettivamente alle estremità 3' e 5'. La sonda è disegnata per ibridizzare la porzione dell'amplicone di PCR fra i primers Fw ed Rv. La differenza tra i campioni nella quantità iniziale di RNA totale contenuto è normalizzata in ogni saggio utilizzando la espressione di gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, un gene espresso costitutivamente, come standard interno.
Ogni reazione di PCR è condotta in un volume finale di 50 l usando il TaqMan Universal PCR Master Mix, 900 nM di primers e 200 nM di sonda altre ai 2,5 ml di cDNA diluito 1/10. ogni campione sarà analizzato in triplicato. Per l'amplificazione in PCR venivano usate condizioni standardizzate (50°C per 2 min, 95°C per 10 min, seguiti da 40 cicli a 95°C per 15 sec, 60°C per 1 min).