RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Nuovi aspetti dell'infiammazione e del rimodellamento nelle patologie ostuttive delle vie aeree

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - SCIENZE FARMACOLOGICHE - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Gianenrico ROVATI

Descrizione

Risultati preliminari
Il laboratorio si occupa da molti anni della farmacologia molecolare degli eicosanoidi, in particolare di cys-LTs, TXA2 e dei loro recettori (7, 24-27). L'interesse è volto al coinvolgimento generale dei cys-LTs nella patofisiologia asmatica (5, 28) e all'uso di farmaci modulatori dei LT come nuovi farmaci anti-asmatici (29-31). Recentemente, abbiamo studiato in cellule umane in coltura la trasduzione del segnale dei cys-LTs. Nelle HASMC abbiamo dimostrato l'attivazione di una isoforma di PKC Ca2+-indipendente nella contrazione (32) e che LTD4 è uno stimolo proliferativo per se, oltre a potenziare la proliferazione indotta da EGF (4). Inoltre, nelle cellule U937 abbiamo osservato che LTD4 induce un segnale di calcio via CysLT1, che coinvolge almeno due vie, una sensibile e una insensibile alla PTX, oltre a proteine isoprenilate, come le subunità bg e Ras (8, 33).
Recentemente abbiamo studiato il ruolo del TXA2 e del suo recettore nella proliferazione delle HASMC, dopo aver dimostrato che possiedono il messaggero per entrambe le isoforme di TPR e che esprimono un recettore funzionale. Abbiamo quindi visto che l'analogo stabile del TXA2, U46619, induce un aumento dose-dipendente della sintesi di DNA e potenzia l'effetto mitogeno di EGF, fenomeni che sono indipendenti dalla transattivazione del recettore per EGF e parzialmente sensibili all'azione della PTX (34). Inoltre, abbiamo dimostrato che i TPR prevalentemente accoppiati a proteine Gi/o sono in grado di attivare la via Ras/ERK per indurre mitogenesi, probabilmente attraverso il coinvolgimento di una tirosinchinasi non recettoriale e di PKC (35).

Obiettivo 1. Caratterizzazione delle vie di trasduzione del segnale mediate da TPR, identificazione dei loro bersagli nucleari e ruolo delle due isoforme espresse in HASMC

Fase 1- Coinvolgimento di PI3K e PKC nella proliferazione di HASMC mediata da TXA2 (8-12 mesi)
Scopo del lavoro è caratterizzare le vie trasduzionali attivate da TPR nella proliferazione HASMC considerando i precedenti risultati ed i dati preliminari che suggeriscono un coinvolgimento sia per PI3K sia per PKC con meccanismi che sembrano essere indipendenti dall'attivazione della via di ERK. In particolare, ci soffermeremo sul coinvolgimento della PKC-zeta, la cui attivazione è stata collegata alla proliferazione di diverse cellule, anche nelle HASMC (36). Per studiare il ruolo di PI3K e di PKC sarà usato il classico approccio farmacologico che impiega inibitori specifici per PKC (GF109203X e il peptide permeabile anti PKC-zeta), PI3K (LY294002 e wortmannina), Akt (SH-5 e SH-6), etc. Inoltre, valuteremo mediante western blot l'attivazione di PKC-zeta e di Akt che è un noto bersaglio di PI3K. Infine, cercheremo di identificare i bersagli intracellulari attivati da ERK1/2 e PI3K (ad es. eIF4E, 4EBP1, S6K, etc.).

Fase 2 – Definizione dell'architettura generale delle vie di trasduzione del segnale che legano il TPR alla proliferatione delle HASMC (6-8 mesi)
Nelle HASMC abbiamo dimostrato che il segnale proliferativo mediato dal TPR è accoppiato a vie sia sensibili sia insensibili alla PTX (34). Pertanto, è nostra intenzione delineare quale delle vie di trasduzione del segnale precedentemente identificate è da attribuirsi alla proteina Gi (probabilmente attivata da TPbetaR) e quale alla via mediata dall'attivazione di Gq (classicamente legata ad entrambe le isoforme). Per produrre questo quadro generale dobbiamo rispondere ad una serie di domande: a) qual è l'abbondanza relativa delle due isoforme recettoriali al variare del n. dei passaggi in coltura; b) entrambe le isoforme contribuiscono in egual misura alla proliferazione delle HASMC e se così non fosse c) quale isoforma è principalmente implicata in una via piuttosto che in un'altra. Per studiare l'espressione dei messaggeri e delle proteine delle due isoforme ai vari passaggi in coltura, svilupperemo una strategia basata su RT-PCR (semiquantitativa e/o quantitativa) affiancata dall'uso di anticorpi specifici per ogni isoforma. Proveremo anche a sovraesprimere ogni isoforma nelle HASMC per evidenziare i segnali attivati in modo specifico, collegando questi risultati con i dati dell'espressione dei trascritti e delle proteine ottenute nel sistema endogeno. Inizialmente cercheremo di usare i comuni metodi di trasfezione liposomica (27), che sono già stati usati nelle HASMC da altri gruppi anche se con una bassa efficienza di trasfezione (<20%). Sarà quindi probabile che, si debba ricorrere all'infezione virale. Dato che è stato osservato che l'attivazione di una specifica via di trasduzione del segnale varia in funzione del livello di espressione del recettore, studieremo l'attivazione delle diverse vie in funzione del livello di espressione di TPR determinato tramite studi di binding recettoriale (27, 34).

Fase 3 – Profilo di espressione genica (4-8 mesi)
Studieremo i geni chiave modulati dall'attivazione di TPR e coinvolti nel controllo del ciclo cellulare mediante "high throughput screening" dell'espressione di diversi geni (macroarray analysis). L'analisi si focalizzerà su geni che codificano per proteine quali cicline, chinasi dipendenti da cicline, altre chinasi che regolano il ciclo cellulare, attivatori della trascrizione, fattori di crescita, citochine e altre proteine implicate nella regolazione del ciclo cellulare. Questi risultati verranno confermati e valutati mediante real time-PCR in un tempo che probabilmente eccederà i due anni della durata di questo progetto di finanziamento.

Obiettivo 2. Ruolo dei cys-LTs nella desensibilizzazione eterologa del beta2-AR in HASMC e in anelli sensibilizzati di bronco umano

Fase 1 – Coinvolgimento dei cys-LTs nella desensibilizzazione di beta2-AR in HASMC (3-6 mesi)
Nel bronco umano sensibilizzato passivamente dopo esposizione ad allergene (37) sono state osservate in vitro numerose disfunzioni correlate con il beta2-AR suggerendo che la sua desensibilizzazione sia dovuta ad uno o più mediatori rilasciati da cellule residenti, in particolare mastcellule, che durante la risposta allergica possono secernere istamina, leucotrieni e PGD2; tra questi, i cys-LTs sembrano essere i candidati maggiormente coinvolti (38).
Al fine di valutare il coinvolgimento dei cys-LTs nella desensibilizzazione del beta2-AR, saranno prodotte curve concentrazione-risposta di accumulo di cAMP dopo stimolazione con isoproterenolo (ISO) su HASMC pretrattate con veicolo o con LTD4. L'analisi comparata dei dati effettuata al calcolatore mediante programma PRISM dimostrerà se LTD4 è in grado di modificare la risposta indotta dalla stimolazione del beta2-AR con ISO. Qualora si producesse una differenza statisticamente significativa nell'efficacia e/o nella potenza di queste curve, si esplorerà il coinvolgimento di PKC o PKA nella desensibilizzazione eterologa del beta2-AR indotta da LTD4 per caratterizzare i meccanismi attraverso i quali i cys-LTs modulano le funzioni del beta2-AR. Verrà pertanto valutato l'effetto prodotto dal pretrattamento con concentrazioni crescenti di GF109203X (inibitore di PKC) o di H89 (inibitore di PKA) sulla risposta indotta da concentrazioni crescenti di ISO dopo somministrazione di LTD4. Inoltre, si cercherà di stabilire una correlazione diretta fra attivazione di CysLTR e desensibilizzazione di beta2-AR utilizzando antagonisti recettoriali selettivi per i CysLT1R quali ad es. montelukast o zafirlukast. Poiché le HASMC esprimono anche il CysLT2R, l'impiego di antagonisti recettoriali selettivi per il CysLT1R permetterà anche di caratterizzare la classe dei recettori coinvolti. Verrà pertanto valutato l'effetto prodotto dal pretrattamento con montelukast o zafirlukast sulle curve concentrazione-risposta di cAMP prodotte da ISO dopo una prima somministrazione di LTD4.

Fase 2 – Coinvolgimento dei cys-LTs nella desensibilizzazione di beta2-AR in anelli sensibilizzati di bronco umano (vedi u. Canonica)
In collaborazione con l'unità Canonica, studieremo se il pretrattamento con montelukast, GF109203X o H89 sia in grado di prevenire la disfunzione del beta2-AR dopo esposizione ad allergene, misurata come riduzione del rilassamento prodotto dai beta2-agonisti in anelli sensibilizzati di bronco umano precontratti con carbacolo.

Fase 3 – Fosforilazione del beta2-AR (4-6 mesi)
Dato che la desensibilizzazione è un processo notoriamente collegato alla fosforilazione recettoriale, si cercherà di dimostrare se nelle HAMC la fosforilazione del beta2-AR avviene attraverso l'attivazione di PKC o PKA. La fosforilazione del beta2-AR mediata da LTD4 verrà studiata mediante western blot con anticorpi policlonali anti-fosfoserina/treonina sul beta2-AR immunoprecipitato con un anticorpo policlonale specifico. La specificità della risposta verrà valutata con un antagonista selettivo per il CysLT1R. Poiché è noto che la fosforilazione dei GPCRs mediata da PKC e PKA è difficile da rilevare in un sistema costitutivo, cercheremo di co-immunoprecipitare PKC o PKA con il beta2-AR usando un anticorpo policlonale specifico per questo recettore.

Obiettivo 3. Ruolo di TXA2 nella desensibilizzazione eterologa del beta2-AR in HASMC e in anelli sensibilizzati di bronco umano

Fase 1-2 (3-6 mesi)
E' noto che le due isoforme di TPR sono entrambe accoppiate a Gq, mentre risultano controllare in modo opposto l'adenilato ciclasi (AC): TPalphaR la stimola mentre TpbetaR la inibisce (39). Pertanto, in parallelo agli esperimenti di desensibilizzazione del beta2-AR indotta dai cys-LTs, si studierà se l'attivazione del TPR produce un'analoga desensibilizzazione e, nel caso, si studierà il coinvolgimento di PKC e/o PKA. Analogamente, l'unità Canonica studierà l'effetto indotto dalla stimolazione del TPR sul rilassamento mediato dai beta2-agonisti in anelli sensibilizzati di bronco umano precontratti con carbacolo. Ogni fase sarà condotta utilizzando l'agonista U46619 e, per valutare la specificità farmacologica delle risposte osservate, l'antagonista recettoriale specifico per il recettore TP, SQ29,548.

Metodi

Colture cellulari
Le HASMC (Invitrogen-Cambrex) saranno coltivate in MEM con 10% FBS, penicillina e streptomicina. Il passaggio sarà effettuato alla diluizione 1:3 in piastre da 75 cm2 e le cellule saranno usate tra il 3° e il 10° passaggio. Le HEK293 verrano coltivate in DMEM con 10% FBS, glutammina, penicillina, streptomicina e 20 mM Hepes pH 7.4.

RT-PCR di TPR
La RT-PCR semiquantitativa sarà effettuata su RNA totale estratto dalle HASMC con il reagente TRIZOL secondo le indicazioni del produttore (GIBCO BRL – Invitrogen). In breve, dopo denaturazione dell'RNA totale (75°C, 3 min), 1-2 microg dello stesso saranno retrotrascritti in presenza di MMLV-RTase in condizioni di reazione ottimizzate. In seguito, 100 ng di cDNA saranno amplificati mediante PCR (Bio-Rad/I-Cycler PCR system) utilizzando Taq Platinum Polymerase e coppie di primers selettivi per l'isoforma alpha o beta del TPR in condizioni di reazione ottimizzate (34). Infine, i risultati saranno normalizzati in relazione all'espressione di un gene controllo.

Western blot di PKC-zeta e Akt
Le cellule, deprivate di siero per una notte, saranno stimolate e lisate come precedentemente descritto (35). In breve, le proteine cellulari saranno risolte con SDS-PAGE e trasferite su membrane, che saranno saturate con latte scremato in polvere e poi incubate a 4°C nel corso della notte con gli anticorpi primari appropriati. Dopo i normali cicli di lavaggio si riveleranno le proteine mediante chemiluminescenza. Altri eventuali bersagli di PI3K ed ERK saranno studiati nello stesso modo usando anticorpi specifici.

Analisi del profilo genico
Le cellule verrano sincronizzate, cresciute in presenza di 10% FBS per 48 ore e poi stimolate. L'RNA verrà poi estratto, purificato e usato per la preparazione del cDNA. L'analisi del profilo genico sarà effettuata usando membrane per l'indagine di geni umani coinvolti nel ciclo cellulare (Atlas Array - Clontech) ibridizzate con 32P-cDNA di HASMC, secondo le istruzioni del produttore. Per studiare i livelli di espressione relativa di ogni singolo gene, le membrane saranno ibridizzate nella notte, sottoposte ad analisi con phosphorimager e lo schema di ibridazione analizzato confrontando i singoli segnali di ciascuna membrana (AtlasImage™).

Trasfezione cellulare in vitro
Il cDNA vettoriale sarà espresso in modo transitorio in HASMC o HEK293. Le cellule ad una opportuna confluenza saranno trasfettate con comuni reagenti liposomici (es. Lipoferctamine o Fugene) secondo le indicazioni del produttore; inoltre, si cercherà di ottimizzare le condizioni sperimentali (tempi, rapporto reagente/DNA ecc.) per ottenere la massima efficienza di trasfezione e, quindi, la massima espressione recettoriale, che sarà valutata mediante binding.

Trasduzione retrovirale di HASMC in vitro
Per l'infezione, le HASMC saranno incubate per 48 ore in 1% PDS/MEM, poi riseminate ad un'opportuna confluenza in 10% FBS/MEM. Dopo 24 ore il terreno di coltura sarà sostituito con 10 ml di stock retrovirale per 12 ore in presenza di 4 mg/ml polybrene (Sigma). Dopo l'infezione, il sovranantante retrovirale sarà sostituito con 10% FBS/MEM e 2.5 mg/ml puromicina. Dopo la selezione con puromicina (24 ore), le cellule saranno coltivate per almeno 4 giorni prima di essere utilizzate per gli esperimenti.

Fosforilazione del beta2-AR
La fosforilazione del beta2-AR sarà valutata su cellule confluenti, deprivate di siero e pretrattate con interferone gamma per 24 ore (esperimenti con LTD4). Dopo opportuna stimolazione, le cellule saranno lisate e sonicate. I campioni saranno chiarificati per centrifugazione e il surnatante incubato con un anticorpo policlonale anti-beta2-AR e una resina di sefarosio. Gli immunoprecipitati saranno centrifugati, lavati, solubilizzati in tampone 2xSDS, risolti mediante SDS-PAGE e trasferiti su membrane di nitrocellulosa. Queste, saranno incubate con un anticorpo policlonale anti fosfo-serina/treonina, lavate e reincubate con un anticorpo policlonale specifico per il beta2-AR per il controllo della quantità totale di proteina. Negli studi di co-immunoprecipitazione, i campioni saranno immunoprecipitati e risolti come prima, ma le membrane saranno incubate con anticorpi monoclonali selettivi per le differenti isoforme di PKC. Gli immunocomplessi saranno rivelati per chemiluminescenza.

Determinatione dei livelli di cAMP
L'accumulo di cAMP sarà valutato su cellule confluenti, deprivate di siero e pretrattate con interferone gamma per 24 ore (esperimenti con LTD4), che saranno stimolate per 10 min in PBS contenente acido ascorbico e isobutilmetilxantina (IBMX). La reazione verrà interrotta in ghiaccio, eseguendo lavaggi con PBS freddo e lisando con HCl. Successivamente, le cellule verranno staccate dai pozzetti e centrifugate (12000 x g). Nei surnatanti verrà effettuata la determinazione della concentrazione proteica e il dosaggio del contenuto di cAMP mediante EIA (Cayman) seguendo le istruzioni del produttore. La concentrazione di cAMP nei campioni incogniti verrà determinata tramite interpolazione da una curva standard.

Binding recettoriale
48 ore dopo la trasfezione si procederà alla verifica dell'espressione recettoriale utilizzando un protocollo di binding di tipo misto (27, 34). In breve, gli esperimenti saranno condotti su cellule adese e confluenti in DMEM-0.2% BSA in presenza di 0.1-3 nM dell'antagonista recettoriale specifico [3H]SQ29,548 e di 0.01 a 10 microM di ligando freddo omologo. Dopo 30 min di incubazione a 25°C, le cellule saranno lavate con PBS e lisate in NaOH e la radioattività misurata mediante scintillazione liquida.

Analisi statistica
Il confronto statistico tra due gruppi sarà effettuato tramite t-test, mentre quello tra più gruppi con l'analisi ANOVA. I dati saranno espressi come media ± SEM. L'analisi dei dati di binding sarà effettuata mediante il programma LIGAND, mentre le curve dose-risposta saranno analizzate utilizzando il programma PRISM 4.