RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Nuovi aspetti dell'infiammazione e del rimodellamento nelle patologie ostuttive delle vie aeree

Università di riferimento

Università degli Studi di PARMA - SCIENZE CLINICHE - PARMA(PR)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Alfredo Antonio CHETTA

Descrizione

METODI

Soggetti


Saranno reclutati venticinque pazienti non fumatori con asma da lieve a moderata e 25 pazienti affetti da BPCO con ostruzione bronchiale da lieve a moderata presso gli ambulatori della Sezione e Unità Operativa di Clinica Pneumologica del Dipartimento di Scienze Cliniche dell'Università di Parma.

Asmatici e pazienti affetti da BPCO dovranno rientrare nei criteri diagnostici per asma e BPCO (14). La presenza di tosse persistente non sarà considerato un criterio necessario per l'inclusione nello studio. Tutti i pazienti dovranno essere clinicamente stabili e non dovranno assumere corticosteroidi nei tre mesi precedenti lo studio e dovranno essere liberi da infezioni del tratto respiratorio nelle 4 settimane precedenti lo studio.

Il grado della severità dell'asma sarà valutato secondo un punteggio di severità dell'asma basato sui sintomi, sull'uso dei broncodilatatori e sulla variabilità giornaliera del picco di flusso espiratorio, misurato durante le tre settimane precedenti il giorno del test di provocazione bronchiale con metacolina. Il range di questo punteggio va da 0 a 12 (15). Lo stato d'atopia sarà valutato con i prick test utilizzando una batteria di 10 comuni allergeni inalanti.

Dieci volontari sani non fumatori saranno reclutati come gruppo di controllo. Tutti i soggetti dovranno dare per iscritto il loro consenso informato per partecipare allo studio.


Spirometria e Test di provocazione bronchiale con metacolina

Il VEMS basale sarà misurato utilizzando un flussimetro di massa connesso a un computer per l'analisi dei dati (Vmax 22, Sensor Medics, Yorba Linda, USA). Il test di provocazione bronchiale con metacolina sarà eseguito secondo le linee guide della Società Europea Respiratoria (16). I soggetti inaleranno delle concentrazioni crescenti al raddoppio di metacolina da 0.03 a 32 mg/ml erogate da un nebulizzatore con dosimetro (output: 9 μl/puff; Mefar, Brescia, Italia). Le inalazioni saranno interrotte quando il VEMS si ridurrà del 20% dal suo valore dopo l'inalazione di soluzione salina. La concentrazione provocante un decremento del 20% nel VEMS (PD20 M) sarà determinata con interpolazione lineare degli ultimi due punti sperimentali ottenuti sulla curva dose-risposta.


Test di provocazione della tosse con Capsaicina

Il test di provocazione della tosse con Capsaicina sarà eseguita secondo la metodica in precedenza già descritta (17). I soggetti inaleranno delle concentrazioni crescenti al raddoppio di capsaicina (Sigma Chemical Co, St Louis, Missouri, USA) da 2 a 500 μM erogate da un nebulizzatore con dosimetro (output: 9 μl/puff; Mefar, Brescia, Italy). La somministrazione di Capsaicina sarà interrotta quando una data dose inalata indurrà 5 colpi di tosse (C5). Questa dose sarà ripetuta per verificarne la riproducibilità e in caso positivo sarà registrata come il valore del soggetto (C5 Capsaicina).


Broncoscopia a fibre ottiche


La broncoscopia sarà eseguita secondo un protocollo in precedenza già descritto (17). La premedicazione consisterà in atropina(0.5 mg) e diazepam (10 mg), entrambi dati per via intramuscolare. L'anestesia locale sarà ottenuta con tetracaina per os assunta in compresse (20mg) 15 minuti prima della broncoscopia. Un aliquota addizionale del 2% di lidocaina sarà data per aerosol alle vie aeree superiori e per via topica alle corde vocali per prevenire colpi di tosse e come anestetico locale. Salbutamolo (1.25 mg) e ipratropio bromuro (0.25 mg) per aerosol saranno inalati dai soggetti per 5 minuti prima della broncoscopia (Model 1T10; Olympus;Giappone). Da tre a cinque prelievi bioptici della mucosa bronchiale saranno prelevati nel bronco lobare medio e inferiore del polmone destro. Quando necessario, dopo la broncoscopia saranno ripetute somministrazioni di salbutamolo e ipratropio bromuro per aerosol. Terminata la broncoscopia, i pazienti saranno accuratamente monitorati in ambito ambulatoriale. Una volta scomparso l'effetto della sedazione e ritornata nei valori di base la funzione polmonare i pazienti saranno congedati.


Processazione delle biopsie

Le biopsie della mucosa bronchiale saranno poste immediatamente nell'acetone ghiacciato, contenente, iodoacetamide, inibitore delle proteinasi (20mM) e fenilmetilsulfonilfluoruro (2mM) per la fissazione. Successivamente saranno conservate a -20°C per 24h e, quindi, trattate con una resina idrosolubile, il glicolmetacrilato (Polysciences, Northampton, UK) (18). Saranno tagliate sezioni di 2 μm e colorate usando anticorpi monoclonali diretti contro i seguenti antigeni umani: collagene di tipo IV (Novacastra Lab., Newcastle, UK) per individuare la lamina basale endoteliale, triptasi (DAKO, Glostrup, Denmark) e EG2 (Pharmacia e Upjohn Diagnostic AB, Uppsala, Sweden) per identificare i mastociti e gli eosinofili e il VEGF (NeoMarkers, Fremont, California) per riconoscere le isoforme 121, 165,e 189 del VEGF. La microscopia ottica sarà eseguita con un microscopio Leica a ingrandimento 100X (Leica, DMLB, Werzlar, Germany)

Il numero dei vasi, dei mastociti, degli eosinofili e delle cellule positive per il VEGF sarà contato in campi non sovrapponibili, ad alta intensità, della lamina propia. Quest'ultima è definita come una zona al di sotto di 100 μm della membrana basale epiteliale ed sarà espressa come il numero di vasi o di cellule per millimetro quadrato della lamina propia. In ogni sezione, saranno esaminati tutti i campi disponibili ad alta intensità e non sovrapponibili e caratterizzati da membrana basale ricoperta da tessuto intatto. L'area vascolare sarà espressa come percentuale dell'area della lamina propia valutata. La misura media dei vasi sarà stimata dividendo l'area vascolare totale per il numero totale dei vasi. Lo spessore della membrana basale sarà misurato come precedentemente descritto (19). Per ogni soggetto i valori finali rappresenteranno la media di almeno due sezioni da due differenti biopsie. Un singolo osservatore all'oscuro delle caratteristiche del soggetto studiato valuterà le sezioni utilizzando un analizzatore di immagine (Leica Q500C; Leica Cambridge,UK). Per ogni soggetto incluso nello studio saranno esaminati in media 8 campi ad alta intensità.


Analisi statistica


I valori saranno rappresentati come media ± deviazione standard (DS).
L'analisi della varianza e il post-hoc test saranno utilizzati per la comparazione delle variabili tra i 3 differenti gruppi di soggetti studiati. Le relazioni tra variabili saranno stimate utilizzando il coefficiente di correlazione di Spearman. Un valore di p inferiore a 0.05 sarà considerato significativo.