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UNITA' DI RICERCA
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Bibliografia
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Programma di ricerca
Lotta biologica e integrata contro Aspergillus carbonarius: effetti sul contenuto di ocratossina A e sulla filiera viti-vinicolaUniversità di riferimento
Università degli Studi del MOLISE - SCIENZE ANIMALI, VEGETALI E DELL'AMBIENTE - CAMPOBASSO(CB)Responsabile dell'Unità di ricerca
Vincenzo DE CICCODescrizione
Testo italianoL'unità operativa lavorerà in collaborazione con le altre Unità Operative del progetto che saranno citate in modo abbreviato come riportato di seguito:
- Unità Operativa Università di Piacenza, responsabile Paola Battilani UO_PC
- Unità Operativa Università di Campobasso, Responsabile Vincenzo De Cicco UO_CB
- Unità Operativa Università di Napoli, Responsabile Alberto Ritieni UO_NA
- Unità Operativa Università di Bari, Responsabile Luigi Macchi UO_BA
L'uso di BCA nella lotta ai funghi fitopatogeni, in particolare a quelli micotossicogeni, può rappresentare una risposta innovativa sia al problema dei residui di fungicidi che arrivano sulla tavola dei consumatori, sia al problema micotossine, che sinora l'uso della lotta chimica non ha risolto. Entrambi rappresentano due importanti questioni della Priorità Tematica 5, Qualità e Sicurezza Alimentare, del 6° Programma Quadro dell'Unione Europea. I BCA sono "elementi attivi", cioè microrganismi vitali potenzialmente in grado di interferire con/inibire la sintesi di tossine, o degradare queste sostanze. Ciò è il caso del lievito antagonista Rhodotorula glutinis LS11 e la micotossina Patulina in vitro e nella pur bassa percentuale di mele trattate col BCA ma attaccate da P. expansum [Castoria et al., 2002; Logrieco et al., 2002; Castoria et al., (in corso di stampa)]. Dati preliminari di questa UO, inoltre, suggeriscono che alcuni ceppi della collezione di antagonisti disponibile siano in grado di degradare OTA in vitro (dati non pubblicati). Un ceppo in particolare, Aureobasidium pullulans LS30 (di cui è noto il fingerprinting molecolare De Curtis et al., 2004), ha inoltre mostrato elevata attività antibotritica su uva in campo, quindi nelle stesse condizioni operative della lotta ad A. carbonarius.
OBIETTIVI DEL PROGETTO DI RICERCA
Gli obiettivi del progetto sono:
- sviluppare procedure innovative per l'abbattimento dell'infezione da Aspergillus carbonarius su uva da vino, mediante metodologie basate sull'uso di agenti di lotta biologica e/o ridotto uso di fungicidi;
- sviluppare procedure innovative per l'abbattimento della contaminazione della micotossina Ocratossina A (OTA) nella filiera vitivinicola.
Per il raggiungimento di questi obiettivi, il progetto prevede:
A) Selezione di BCA sulla base di:
- elevata attività antagonistica contro A. carbonarius su cvv di uve da vino a bacca nera;
- buona compatibilità con fungicidi e insetticidi usati nell'ecosistema-vite in disciplinari di agricoltura biologica e integrata;
- sopravvivenza in presenza di OTA in vitro e in bacche infettate da A. carbonarius (o artificialmente contaminate con OTA) e capacità di degradazione della micotossina;
B) Valutazione dell'efficacia del/i BCA selezionato/i mediante:
- Prove di lotta biologica ed integrata in campo con il/i BCA selezionato/i;
- studio della sopravvivenza e della dinamica di popolazione in vigneto (numero cellule per unità di superficie vegetale) del/i BCA selezionato/i, attraverso l'uso di sonde molecolari specifiche e Real Time PCR;
- determinazione della presenza di OTA da campioni prelevati dalle prove in campo;
- determinazione della presenza di residui di fungicidi da campioni prelevati dalle diverse tesi nelle prove in campo.
Le prove sperimentali in vigneto verranno condotte sia dall'UO_PC che da questa UO, allo scopo di valutare i BCA in aree con differenti caratteristiche climatiche e su cultivar diverse di uva da vino.
ATTIVITÀ SPERIMENTALE
1° anno (primo semestre)
1. Selezione di BCA con elevata attività antagonistica contro A. carbonarius su uve da vino a bacca rossa.
Questa UO possiede una collezione con diversi BCA in grado di contenere i principali patogeni di ortofrutticoli in postraccolta e in pieno campo (Lima et al., 2002a; Lima et al., 2002b). Tra gli isolati della collezione saranno individuati quelli in grado di contenere le infezioni di A. carbonarius. In questa fase del progetto saranno condotte prove di antagonismo in laboratorio su bacche e grappoli di uva da vino tipiche dell'area centro meridionale, con isolati BCA della collezione di questa UO, allo scopo di individuare e selezionare quelli con la più elevata attività contro A. carbonarius.
2. Selezione di BCA compatibili con fungicidi e insetticidi usati sulla vite nei disciplinari di agricoltura biologica e integrata. Questo ed altri laboratori hanno ottenuto ottimi risultati integrando BCA con fungicidi a concentrazioni ridotte: livelli di contenimento delle infezioni persino superiori ai trattamenti con fungicidi a dose piena (Chand-Goyal and Spotts, 1997; Lima et al., 1998; Lima et al., 2003). Questa strategia, oltre a raggiungere un maggiore abbattimento delle infezioni, ha sensibilmente ridotto i livelli dei residui di fitofarmaci nel prodotto ortofrutticolo. Tra gli isolati della collezione di questa UO saranno individuati quelli in grado di contenere le infezioni di A. carbonarius in presenza di fungicidi e insetticidi, il cui uso è disciplinato nei regolamenti UE per l'agricoltura biologica e integrata (ex Reg. CE 2078).
Questa fase del progetto consisterà in:
selezione degli isolati in vitro -su terreno di coltura agarizzato e liquido-, e in vivo -su bacche e grappoli d'uva da vino-, capaci di tollerare/resistere a zolfo, rameici, strobilurine, inibitori della sintesi degli steroli (IBS), iprovalicarb, ciprodinil, fludioxonil, nonché agli insetticidi ammessi nei disciplinari citati.
1° anno (secondo semestre)
3. Sopravvivenza dei BCA in presenza di OTA e degradazione della micotossina in esperimenti di laboratorio. L'uso di fungicidi, per quanto efficace, non può azzerare gli attacchi dei miceti patogeni e, nel caso dei micotossicogeni, la pur bassa percentuale di piante/derrate attaccate è fonte della contaminazione da micotossine. Una volta avvenuta l'infezione da parte del fungo micotossicogeno, il fungicida residuo non appare in grado di inibire la sintesi delle tossine.
Per contro, i BCA sono "elementi attivi", cioè microrganismi vitali potenzialmente in grado di interferire con/inibire la sintesi di tossine, o degradare queste sostanze. Ciò è stato verificato da questa UO nel caso della micotossina Patulina [Castoria et al., 2002; Logrieco et al., 2002; Castoria et al., (manoscritto in preparazione)].
A questo scopo sarà necessario sottoporre ad un'ulteriore selezione i BCA di questa UO per individuare quelli con elevata attività di degradazione e/o di metabolizzazione a carico di OTA.
Questa fase del progetto consisterà in:
- selezione in vitro, su substrati di coltura contenenti OTA, dei BCA in grado di sopravvivere in presenza di dosi diverse della tossina;
- selezione in vivo, su bacche e grappoli d'uva da vino inoculati con A. carbonarius e/o contaminati con OTA, dei BCA in grado di rimanere vitali anche in presenza di infezione e in grado di determinare una riduzione della contaminazione di OTA nelle bacche infettate.
- I campioni derivanti dai 2 set di esperimenti saranno divisi in tre subcampioni. Uno destinato all'analisi HPLC, per valutare la presenza di OTA incubata coi BCA (possibile degradazione e/o metabolizzazione della tossina) (questa UO), uno destinato all'analisi e caratterizzazione dei metaboliti derivanti dalla possibile degradazione e/o metabolizzazione di OTA (UO_NA), il terzo destinato alla determinazione degli effetti citotossici di OTA e dei possibili prodotti di degradazione (UO_BA).
Al termine delle fasi del 1° anno di attività saranno selezionati 1-3 isolati sulla base delle migliori prestazioni come BCA e come possibile agenti di detossificazione dell'OTA, che saranno usati negli esperimenti del 2° anno. Gli stessi isolati sarnno forniti all'UO_PC per esperimenti analoghi a quelli riportati nel punto 5.
2° anno
4. Sopravvivenza dei migliori BCA in esperimenti di laboratorio.
Gli strumenti molecolari oggi disponibili permettono di caratterizzare a livello genomico qualsiasi microrganismo. Ciò è necessario sia alla registrazione di BCA da utilizzare come biofungicidi, sia a studi di persistenza dei BCA nell'ecosistema, condizione necessaria per un'efficace attività di lotta biologica. La nostra UO ha eseguito analisi fAFLP (fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism) su alcuni BCA in collezione, che hanno consentito di individuare frammenti di DNA isolato-specifici che caratterizzano detti BCA e che potrebbero essere usati per la preparazione di sonde molecolari da impiegare per il monitoraggio di questi microrganismi (De Curtis et al., 2004). Alla luce di questi strumenti e conoscenze, in questa fase del progetto saranno eseguite:
Analisi e caratterizzazione mediante fAFLP di 1-3 BCA selezionati nelle fasi precedenti, ed indagini di laboratorio sulla loro sopravvivenza e dinamica di popolazione su grappoli di uva da vino, attraverso il reisolamento dalle bacche trattate, la conta delle Unità Formanti Colonia (UFC) e conferma della loro identità mediante analisi fAFLP.
5. Prove in campo di lotta biologica ed integrata con il migliore BCA e valutazione della degradazione di OTA.
L'uso di BCA nella lotta ai funghi fitopatogeni rappresenta una risposta realistica alle problematiche derivanti dall'uso dei fungicidi: residui nelle produzioni agroalimentari; crescente limitazione dei principi attivi autorizzati in agricoltura (sarà vietato l'uso di circa 300 principi attivi); insorgenza di ceppi di patogeni resistenti; contaminazione con micotossine. Esistono in commercio diversi biofungicidi registrati contro patogeni postraccolta e patogeni responsabili di malattie radicali e fogliari.
In questa fase saranno eseguite:
prove di lotta biologica ed integrata in campo con 1-3 isolati selezionati di BCA, in un vigneto in collina e in uno in pianura, entrambi con sistema di allevamento a spalliera (Guyot doppio).
Negli stessi esperimenti, seguendo un opportuno schema statistico, saranno prelevati campioni per l'analisi HPLC dell'OTA (questa UO), per l'analisi dei metaboliti derivanti dalla possibile degradazione e/o metabolizzazione della tossina (UO_NA) e per la determinazione degli effetti citotossici di OTA e dei possibili prodotti di degradazione (UO_BA). Saranno inoltre prelevati campioni per l'analisi quantitativa dei residui di fungicidi utilizzati (UO_NA).
RISULTATI ATTESI
- Selezione di 1-3 BCA con elevata attività protettiva dalle infezioni da A. carbonarius su uva da vino;
- sviluppo di protocolli preliminari di applicazione per l'impiego di BCA in programmi di lotta biologica ed integrata;
- identificazione di BCA capaci di ridurre la contaminazione di Ocratossina A.
Ricaduta/proseguimento naturale del progetto sarà l'identificazione di microrganismi/attività enzimatiche utili alla detossificazione dell'OTA, da valutare per il loro possibile utilizzo nelle fasi finali della filiera viti-vinicola.
