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UNITA' DI RICERCA
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Bibliografia
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Programma di ricerca
Lotta biologica e integrata contro Aspergillus carbonarius: effetti sul contenuto di ocratossina A e sulla filiera viti-vinicolaUniversità di riferimento
Università degli Studi di BARI - CLINICA MEDICA, IMMUNOLOGIA E MALATTIE INFETTIVE - BARI(BA)Responsabile dell'Unità di ricerca
Luigi MACCHIADescrizione
Il programma di ricerca dell'Unita' Operativa sara' sviluppato secondo le seguenti linee.1) Studi sulla tossicita' dell'ocratossina A in differenti linee cellulari di mammiferi ed invertebrati.
Gli effetti citotossici dell'ocratossina A sono stati studiati in vari modelli cellulari. Tuttavia il quadro complessivo che da questi studi emerge e' lontano dall'essere completo. Pertanto, al fine di raccogliere le informazioni necessarie ad attuare esperimenti volti ad accertare la potenziale citotossicita' di metaboliti dell'ocratossina derivanti dall'intervento di controllo biologico con microorganismi efficaci nella lotta all'Aspergillus carrbonarius e che verranno purificati ed identificati dall'Unita' Operativa di Napoli, in una prima fase del progetto noi porteremo avanti studi sulla tossicita' dell'ocratossina A in cellule di mammiferi utilizzando uno spettro relativamente largo di line cellulari, rappresentative di vari tipi cellulari e specie. Le linee cellulari che si progetta di valutare come biosensori dell'ocratossina A sono: la linea promielocitica umana HL-60 (di origine leucemica), la linea monocitoide umana U937 (di origine linfomatosa), la linea mast cellulare di ratto RBL-1 (leucemica; queste tre linee cellulari sono rappresentative del liniaggio mieloide), la linea di carcinoma cervicale umano HeLa, la linea di carcinoma della mammella umano MCF-7, la linea di epatoma umano HepG2 (queste tre linee cellulari sono rappresentative del linaiggio epiteliale), la linea fibroblastoide di scimmia CV-1 e la linea fibroblastoide di topo 3T3 (questi due modelli cellulari sono rappresentativi dei tipi cellulari del tessuto connettivo). Infine, la linea cellulare SF-9 (derivata da cellule ovariche della forma pupale del lepidottero Spodoptera frugiperda) sara' usata come un modello di confronto costituito da cellule di inverterato. Tests di citotossicita' saranno eseguiti esponendo le cellule indicate sopra a varie concentrazioni della micotossina per tempi compresi tar i pochi minuti e le 24 ore.
Questo lavoro di ricerca sara' sviluppato durante i mesi 1-12 del progetto.
2) Studi sui meccanismi cellulari e molecolari della tossicita' da ocratossina A, in particolare sui meccanismi pro-apoptotici.
Nonostante il considerevole lavoro di ricerca svolto negli ultimi anni, i meccanisni della tossicita' da ocratossina rimangono in larga misura oscuri. Pertanto, concentreremo la nostra attenzione sull'apoptosi e studieremo la potenziale attivita' pro-apotogenica dell'ocratossina A, in alcuni dei modelli cellulari descritti sopra. In particolare, le linee cellulari HL-60, RBL-1 e CV-1 potrebbero costituire modelli adatti all'esecuzione di esperimenti preliminari in relazione alla maggiore semplicita' di coltivazione ed alla loro provata suscettibilita' all'apoptosi indotta da altre micotossine. Le tecniche di studio dell'apoptosi che saranno usate comprenderanno: analisi elettroforetica di DNA genomico, microscopia a fluorescenza con colorazione con ioduro di propidio ed assay enzimatico per caspasi 3 e caspasi 9. Questo lavoro di ricerca sara' svolto dal mese 4 al mese 15 del progetto.
3) Stabilimento delle condizioni per l'analisi di citotossicita' di ocratossina A contenuta in matrici reali. Usando le informazioni raccolte con i modelli cellulari gia' descritti ed usati come biosensori (punto 1), cercheremo di standardizzare un assay di citotossicita' per ocratossina A in matrici reali, come uva, mosto e vino. Anche in questo caso, tre modelli cellulari saranno selezionati, in relazione alla loro sensibilita' all'ocratossina ed alla loro rappresentativita'. In un primo set di esperimenti, ocratossina A sara' inclusa in adatti substrati sicuramente esenti da contaminazione con la micotossina, al fine di definire le condizioni sperimentali in relazione a concentrazioni note di ocratossina A. Successivamente, cercheremo di eseguire simili esperimenti con matrici reali contaminate. Questi sperimenti saranno portati avanti nel periodo di tempo compreso tra il mese 8 ed il mese 14 del progetto di ricerca.
4) Studi sui potenziali effetti citotossici dei prodotti di degradazione dell'ocratossina A.
I modelli cellulari saranno gli stessi standardizzati durante il primo anno di lavoro, svolto con la micotossina purificata. In collaborazione con le Unita' Operative di Piacenza e Napoli, verranno innanzitutto esaminati gli effetti svolti da campioni di materiale purificato o semi-purifcato. Successivamente si cerchera' di stimare la potenziale attivita' pro-citotossica oppure, alternativamente, di stabilire l'assenza di tale attivita' in matrici reali (in collaborazione con l'Unita' di Piacenza). Questo lavoro sara' portato avanti durante il secondo anno di attivita'.
5) Studi sui potenziali effetti pro-apoptotici dei prodotti di degradazione dell'ocratossina A.
Allo stesso modo, qualora effetti tossici attribuibili a prodotti di degradazione della micotossina verranno individuati, cercheremo di ottenere informazioni sui meccanismi d'azione riferibili a tale attivita' citotossicica, particolarmente in relazione ad una potenziale attivita' pro-apoptotica. Anche questo lavoro di ricerca verra' sviluppato nel secondo anno del progetto.
