RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

L'ozono come strumento per lo studio dello stress biotico ed abiotico nelle piante: analogie e divergenze nelle risposte di compensazione e difesa, inducibilità crociata e protezione crociata

Università di riferimento

Università degli Studi "Mediterranea" di REGGIO CALABRIA - BIOTECNOLOGIE PER IL MONITORAGGIO AGROALIMENTARE E AMBIENTALE - REGGIO CALABRIA(RC)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Maurizio BADIANI

Descrizione

Questa UR si pone come obiettivo di incrementare le conoscenze dei meccanismi fisiologici, biochimici e molecolari coinvolti nella risposta delle piante a diversi stress biotici ed abiotici di natura ossidativa. In virtù sia della sua capacità di evocare risposte di difesa comuni anche ad altri tipi di stress, sia della versatilità, praticità e riproducibilità del suo uso sperimentale, l'O3, somministrato a livelli realistici sarà il fattore di stress adottato da tutte le UU.RR., ciascuna delle quali poi assocerà a questo, mediante esposizioni combinate e/o sequenziali, uno o più fattori biotic/abiotici addizionali. Il fine ultimo è quello di individuare, sulla base di quanto è gia noto e tramite la realizzazione di esperimenti ad hoc, similarità e divergenze nei cammini di percezione/generazione e trasduzione del segnale/difesa/riparazione in risposta a stress di origine diversa. L'eventuale messa in evidenza di "induttività crociata" nelle risposte di difesa potrebbe plausibilmente avere importanti risvolti in termini di "resistenza crociata" a stress di natura diversa. Ciò potrebbe condurre all'individuazione di marcatori molecolari utili nella selezione di materiale resistente e/o di geni di resistenza utili da trasferire mediante miglioramento convenzionale o trasformazione genetica.

Disponendo di linee mutanti e transgeniche di particolare interesse per lo studio delle risposte di difesa all'O3 e ad altri stress di natura abiotica, questa UR prevede di utilizzare il pomodoro (Lycopersicon esculentum Mill.) quale sistema vegetale modello. Gli obiettivi specifici che la UR si propone di perseguire nel presente Progetto possono essere così schematizzati:

1) Utilizzazione di un sistema modello stress-sensibile (linea di pomodoro autonecrotica) per lo studio delle risposte comuni/differenziali a stress abiotici di diversa natura.

2) Effetti dell'espressione di un transgene codificante per l'inibitore di proteasi cistatina sia sulla risposta del mutante autonecrotico all'O3 sia sulla tolleranza/resistenza nei confronti di alti livelli di irradianza e temperatura.

3) Impiego di mutanti di pomodoro con alterato contenuto di composti antiossidanti nelle foglie (antocianine, polifenoli, xantofille e clorofilla) per la valutazione del loro ruolo protettivo nei confronti dello stress da ozono.

A. Materiale vegetale sperimentale

1. Mutanti per la presenza/assenza di antocianine e rispettive linee quasi isogeniche normali:
- mutante a (anthocyanin less), caratterizzato dall'assenza di antocianine negli steli e nelle foglie;
- mutante atv (atroviolacea), caratterizzato da un eccesso di produzione di antocianine nelle foglie, negli steli e nei frutti, derivante da una popolazione naturale di Lycopersicon delle Galapagos (Rick 1963).

2. Mutante per maggior contenuto di clorofilla nelle foglie e nella bacca:
- mutante green flesh (gf), nel quale la clorofilla è persistente e conferisce ai frutti maturi un colore marrone. Descritta inizialmente solo per le caratteristiche conferite al frutto (Kerr 1956), questa mutazione determina il fenotipo "stay green" anche alle foglie, le quali, durante la senescenza, mostrano, rispetto ai wild type, solo lieve degradazione di clorofilla e carotenoidi, mentre sembrano risultare protetti i polipeptidi del complesso antenna del fotosistema II (Akhtar et al. 1999).

3. Mutanti per il maggior contenuto di tutti i pigmenti (clorofilla, antocianine e caroteni):
- mutanti non allelici hp-1 (high pigment) e hp-2 (geni cosìddetti enhancer), che presentano, rispetto al normale, un aumento dal 10 al 90% di tutti i pigmenti (Palmieri et al. 1976). Il prodotto proteico del gene HP-1 normale sembra essere un regolatore negativo della trasduzione del segnale del fitocromo. Poiché la trascrizione della CHS è influenzata dalla luce, l'assenza di tale regolazione nel mutante hp-1 potrebbe condurre ad un'alterata biosintesi dei flavonoidi, confermata da un contenuto di quercetina 13 volte superiore rispetto al wild type (Yen et al. 1997). L'aumento della quercetina, ma anche delle antocianine, suggerisce che il locus hp-1 possa controllare la biosintesi di diverse classi di flavonoidi. Il gene hp-2 determina un più elevato contenuto di antocianine in vari tipi di tessuto, con localizzazione preferenziale nelle cellule subepidermiche, nel collenchima e nelle cellule basali dei tricomi (Mustilli et al. 1999).

4. Mutante autonecrotico
La linea mutante necrotica V20368 è stata identificata nel 1998 in una progenie in selezione per resistenza a malattia ed è stata in seguito accertata la sua corrispondenza con i materiali studiati da Rick e Butler (1956) e da Kruger et al. (2002) (Santangelo et al. 2003). In presenza di temperature crescenti ed alta intensità luminosa, V20368 sviluppa aloni clorotici che evolvono in necrosi localizzate a danno della superficie fogliare abassiale, con andamento acropeto sia a livello di foglia composta che di pianta intera. Tale manifestazione è causata da un'interazione tra il gene Cf-2 (derivante da L. pimpinellifolium e conferente resistenza a Cladosporium fulvum, agente causale della cladosporiosi del pomodoro) ed il gene Rcr3 di L. esculentum, codificante per una cistein-proteasi. V20368 è sensibile anche a stress di tipo chimico: il trattamento con l'insetticida organofosforico fenthion (O,O-dimetil-O-[3-metil-4-(metiltio) fenil] fosforotioato) induce anch'esso la comparsa di necrosi fogliare localizzata, nonostante che la linea, non esprimendo un gene dominante Fen, sia da considerare insensibile all'insetticida dal punto di vista genetico. L'interazione Cf-2/Rcr3esc potrebbe dunque determinare una maggiore sensibilità della pianta a rispondere a stimoli chimici e ambientali, o abbassando la soglia di percezione dello stress, o causando stress ossidativo, oppure accelerando processi di senescenza in cui siano coinvolte le cistein-proteasi.
Fonzo et al. (2003) hanno osservato in V20368 un aumento significativo della produzione di ET durante la fase di diffusione delle necrosi, in particolare nelle foglie basali ed apicali. Come è noto, la produzione di "etilene da stress", indotta da numerosi agenti di origine sia biotica che abiotica, è associata alla formazione di acido cianidrico (HCN), tossico per enzimi quali citocromo c ossidasi, Rubisco, SOD, POX e CAT (Smith ed Arteca 2000), per il quale è stato anche proposto un possibile ruolo come segnale cellulare localizzato. Le piante, a differenza degli animali, possiedono meccanismi di detossificazione rapida di HCN. Uno di questi è costituito dall'enzima b-cianoalanina sintasi (b-CAS), che metabolizza HCN incorporandolo in asparagina. L'attività della b-CAS è prevalentemente localizzata nella frazione mitocondriale, presumibilmente a difesa del sistema di trasporto elettronico ivi residente (METS), mentre la produzione di HCN dalla sintesi di ET è citosolica. In presenza di condizioni che inducono rapida morte cellulare (es. infezione da patogeni), la produzione di ET viene stimolata, mentre quella della b-CAS si riduce, determinando così forti concentrazioni di HCN in vivo. Il conseguente avvelenamento della citocromo c ossidasi porta alla diversione del flusso elettronico dal METS all'O2, con aumentata formazione di ROS. Ciò induce l'attivazione di una respirazione CN--resistente che riduce la formazione di ROS mitocondriale attraverso l'azione della cosiddetta ossidasi alternativa (AOX). Recentemente, Vahala et al. (2003) hanno osservato in betulla che l'attivazione della b-CAS richiede una via di segnalazione ET-dipendente che sia funzionale. Una diminuzione nella sensibilità ad ET può compromettere tale detossificazione, mentre, in presenza di specifiche condizioni, una biosintesi di ET particolarmente stimolata, come osservato in V20368, potrebbe risultare nella morte cellulare di tipo necrotico a seguito di insufficiente detossificazione di HCN.
Samuilov et al. (2002) hanno anche osservato che, in pisello, un'illuminazione di circa 1000 lx promuove apoptosi CN--indotta nelle cellule di guardia, contenenti cloroplasti e mitocondri, ma non delle cellule epidermiche, contenenti solo mitocondri. Il processo può essere prevenuto da antiossidanti, anaerobiosi, staurosporina (inibitore specifico della proteina chinasi C, PKC) e inibitori delle proteasi a cisteina ed a serina. Gli autori ipotizzano che l'apoptosi delle cellule di guardia dipenda dalla simultanea presenza di due fattori, ROS e plastochinoni mantenuti allo stato ridotto, a causa dell'avvelenamento CN--dipendente della Rubisco. Questi ultimi attiverebbero la PKC, che a sua volta darebbe inizio alla PCD. Una sequenza di eventi analoga potrebbe essere coinvolta nell'avvelenamento CN--dipendente del METS, essendo in questo caso gli ubichinoni ridotti e la citocromo c ossidasi le rispettive controparti funzionali interessate. In V20368, quindi, un'alterazione costitutiva o indotta (dalle condizioni ambientali), regolata dall'interazione Cf-2/Rcr3esc, potrebbe condurre ad un'elevata sintesi di ET la quale, se associata ad una ridotta induzione di b-CAS e di AOX, potrebbe determinare accumulo di HCN e conseguente inibizione del METS, causando un'aumentata produzione di ROS nel mitocondrio ed infine sfociando nella manifestazione necrotica visibile (Overmyer et al. 2003).

5. Linea transgenica per la cistatina:
- linea BG 106-6, transgenica per il gene Atcys da A. thaliana codificante per la cistatina, un inibitore delle cistein-proteasi. Studiando l'interazione tra la linea trasformata e l'insetto polifago Helicoverpa armigera, in grado di causare gravi danni ai frutti, è emerso che il livello di cistatina presente in BG 106-6 è sufficiente per interferire negativamente con il ciclo biologico dell'insetto.

B. Fasi del Progetto e trattamenti sperimentali.
Nell'arco della durata del Progetto, l'attività sperimentale prevista verrà come di seguito articolata:

Fase I, corrispondente al I anno della ricerca

1) Introduzione del transgene per la cistatina nella linea mutante autonecrotica

- Realizzazione di incroci (reciproci compresi) tra BG-106 e V20368; allevamento delle F1 e raccolta di seme F2.

- Semina delle F2 ed individuazione mediante PCR dei ricombinanti possedenti i geni per l'autonecrosi e la cistatina


2) Trattamento di plantule allo stadio 4a foglia con dosi realistiche di O3 e con differenti livelli di agenti di stress fisico e chimico (vedi oltre), in modo singolo e combinato, secondo il seguente schema:

a) Per i mutanti gf, hp2, a ed atv: ozono x elevati livelli di irradianza e temperatura

b) Per la linea transgenica BG106, per il mutante V20368 e per individui F2 doppio mutante (Atcys ed Rcr3) saranno applicate 2 combinazioni:

b1) ozono x elevati livelli di irradianza e temperatura
b2) ozono x insetticida organofosforico fenthion


Fase II, corrispondente al II anno della ricerca

Proseguimento dell'attività di cui al punto 2 della Fase I


Per i trattamenti sperimentali verranno utilizzati sistemi di laboratorio, già operativi presso la UR, costituiti da camere di crescita opportunamente modificate ed equipaggiate in grado di erogare in modo preciso, sensibile e riproducibile dosi di O3 ad libitum, garantendo nel contempo la modulazione ed il controllo delle restanti condizioni ambientali, in particolare livelli di irradianza e temperatura. Lo stress da O3 verrà imposto esponendo il materiale vegetale a due livelli di inquinante: 0 (controllo) e 150 nL L-1 per 5 ore. Le temperature di allevamento da testare saranno 20 e 35 °C, combinate con tre diversi livelli di fluenza fotonica fotosintetica ad altezza pianta, orientativamente pari 80-100 (bassa irradianza), 500-600 (irradianza ambientale media) e 1000-1200 (irradianza ambientale elevata) mmol m-2 s-1. Per quanto riguarda l'esposizione allo stress chimico, ed in accordo con i nostri precedenti studi (De Biasi et al. 2003), le piante verranno sottoposte a spray fogliare con una sospensione acquosa al 10% di Lebaycidâ (Bayer AG, Leverkusen Bayerwerk, Germania), una formulazione commerciale del fenthion.

C. Analisi
Gli effetti dei trattamenti sperimentali sul materiale vegetale verranno valutati attraverso lo studio dei seguenti aspetti:

a) sintomatologia:
valutazione e comparazione della sintomatologia fogliare, sia per apprezzamento visivo che mediante analisi microscopica abbinata ad analisi di immagine; valutazione dell'entità della pigmentazione, della presenza di aree decolorate o iperpigmentate e delle loro dimensioni;

b) PCD ed eventi molecolari correlati:
quantificazione e comparazione della PCD mediante Evan's Blue; abbondanza dei trascritti dei geni Rcr3 ed Atcys; produzione di ET e di HCN; capacità mitocondriale di detossificazione di CN- in termini di espressione della b-CAS; verifica del danno a livello mitocondriale mediante quantificazione del rilascio di citocromo c nel citosol ed espressione (dosaggio enzimatico, immunoquantificazione e livello dei trascritti) dell'ossidasi mitocondriale CN--resistente (in collaborazione con la UR- 2005075991_002) ;

c) generazione del burst ossidativo:
quantificazione della produzione stress-dipendente di H2O2, superossido ed ossido nitrico (in collaborazione con la UR- 2005075991_003); isolamento e caratterizzazione di frazioni arricchite in vescicole di membrana plasmatica; attività enzimatica, abbondanza della proteina e livello dei trascritti della H+-ATPasi del plasmalemma; attività enzimatica di NAD(P)H-Ox;

e) sistemi antiossidanti:
dosaggio dei livelli/attività di metaboliti ed enzimi antiossidanti; tra i primi, i pools di AsA e GSH; tra i secondi, sia le attività coinvolte nella rimozione diretta delle ROS, quali APX, POX, SOD e CAT, sia quelle coinvolte nella rigenerazione delle forme redox-attive di ascorbato e glutatione, cioè MDHAR, DHAR e GR; analisi di espressione dei geni corrispondenti;

f) pigmenti fotosintetici e pigmenti ad azione fotoprotettiva ed antiossidante
dosaggio delle clorofilla, dei caroteni, delle xantofille e delle antocianine (pelargonidine, cianidine, delfinidine); analisi di espressione dei geni chiave coinvolti sia nella biosintesi (acido d-amminolevulinico deidratasi; fitoene sintasi; b-carotene idrossilasi) che nella degradazione (clorofillasi, feoforbide a ossigenasi) dei pigmenti fotosintetici; dosaggio di enzimi chiave sia del metabolismo fenilpropanico generale, quale la PAL, sia della sintesi dei flavonoidi, quali CHS e CHI; analisi di espressione dei geni corrispondenti e di quelli coinvolti sia nella conversione dei diidroflavonoli in antocianidine, quale la diidroflavonolo 4-reduttasi, sia nella conversione delle antocianidine ad antocianine, quali la antocianidina sintasi e la UDP glucosio:flavonoide 3-O-glucosiltrasferasi;

g) scambi gassosi ed assorbimento/utilizzazione dell'energia luminosa
misura di fotosintesi, conduttanza stomatica e traspirazione fogliare; misura della fluorescenza della clorofilla a in vivo e calcolo dei principali indici correlati ad assorbimento ed utilizzazione dell'energia luminosa

Per gli studi in programma verranno impiegate tecniche convenzionali di analisi dei gas nell'infrarosso, fluorimetria, citologia, istologia, microscopia, gas-cromatografia e cromatografia liquida ad alta prestazione, estrazione e purificazione di strutture di membrana, enzimologia, immunoblotting, bioinformatica, estrazione e purificazione di acidi nucleici, isolamento, amplificazione e sequenziamento di specifiche sequenze nucleotidiche, ibridazione di sequenze nucleotidiche omologhe. Tutte le predette tecniche verranno applicate da personale addestrato ed esperto afferente alla UR. Le principali apparecchiature necessarie per l'esecuzione della ricerca sono già tutte disponibili ed operative. Le sequenze parziali o totali della maggior parte dei geni di pomodoro di cui si prevede di studiare l'espressione risultano già disponibili in banca dati.