RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Qualità, percezione della qualità e tracciabilità del prodotto nei sistemi ovini da carne

Università di riferimento

Università degli Studi di FIRENZE - SCIENZE ZOOTECNICHE - FIRENZE(FI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Alessandro GIORGETTI

Descrizione

L'UR di Firenze lavorerà in collaborazione con le UURR di Udine (coordinatore), Perugia, Campobasso e Catania allo studio di razze
di interesse locale a rischio e non di estinzione (Udine: Istriana; Campobasso: Merinizzata Italiana ; Perugia: Appenninica;
Catania: Comisana; Firenze: Pomarancina).
Firenze provvederà allo studio della produzione di agnello leggero di pecora Pomarancina e alla caratterizzazione genetica della
stessa razza e di quelle studiate dalle altre UURR.
Nella fase 1, si provvederà alla produzione di 2 tipologie di agnello leggero rappresentative del sistema di allevamento:
semi-estensivo, con prevalenza di pascolo e semi-intensivo con prevalenza di alimentazione alla stalla; nel sistema semiestensivo sarà considerata la produzione dell'agnello autunnale e quello primaverile.
Gli agnelli saranno allevati ed alimentati secondo metodologie per quanto possibile uniformi alle altre UURR, pur nel rispetto delle
prerogative di tipicità' locale delle aree di allevamento della Pomarancina (Pomarance, Volterra, Castelnuovo Val di Cecina,
Montecatini Val di Cecina, in provincia di Pisa).
A tal fine verranno individuate aziende adatte ad ospitare la prova e che abbiano una sufficiente consistenza di capi.
Durante tutta la fase di allevamento, si effettuerà, secondo uno schema comune alle altre UURR, il regolare campionamento degli
alimenti consumati dagli agnelli. Questi saranno successivamente inviati alle UURR impegnate nell'autenticazione della carne.
Le metodologie di macellazione, di preparazione e frollatura della carcassa, i rilievi e prelievi sulla stessa, le procedure di
conservazione dei campioni, nonché la dissezione e lo spolpo del taglio campione, saranno quelle suggerite dall'Associazione
Scientifica di Produzione Animale (A.S.P.A., 1991. Metodologie relative alla macellazione degli animali di interesse zootecnico e
alla valutazione e dissezione della loro carcassa. ISMEA, Roma).
La Fase 1 si concluderà con lo scambio reciproco dei campioni fra le diverse UURR.
Verranno prodotti, compatibilmente con la possibilità di reperirne un numero sufficiente data la situazione della razza, 24 soggetti per la tipologia di alimentazione/allevamento della madre semi-estensiva e 12 soggetti per la tipologia semi-intensiva. Dei 24 soggetti provenienti da allevamenti semi-estensivi, 12 saranno prodotti in autunno e 12 in primavera, cercando in questo modo di individuare le influenze sulle caratteristiche qualitative della produzione indotte dalla diversa qualità dei foraggi assunti al pascolo dalle madri in allattamento.
I tre gruppi di 12 agnelli per un totale di 36 soggetti, saranno scelti cercando di garantire il massimo livello possibile di omogeneità.
L'acqua di abbeverata, il latte, i foraggi (pascolati e non) ed i concentrati consumati dagli agnelli e/o dalle pecore allattanti
verranno regolarmente campionati, conservati ed inviati all'UR di Udine e di Catania, impegnate nell'autenticazione della carne.
Al raggiungimento del peso previsto, gli agnelli saranno trasportati in uno stabilimento di macellazione e lavorazione della carcassa
dotato di bollo UE per gli ovini.
Le carcasse, ottenute secondo la metodologia suggerita dall'Associazione Scientifica di Produzione Animale (A.S.P.A., 1991. op.cit.),
dopo essere state pesate e valutate (Reg. CEE n. 2137/1992 e n. 461/1993 e successive modifiche ed integrazioni) entro un'ora
dall'abbattimento, saranno mantenute a temperatura ambiente (> 10°C) per 6 ore prima di essere raffreddate a 2°C. Dopo 24 ore
dall'abbattimento, su ciascuna carcassa saranno rilevati il peso e le misure (A.S.P.A., 1991. op. cit.). Le carcasse di ciascuna
tipologia saranno fotografate per la costituzione di standard di riferimento.
All'atto della preparazione della carcassa da ciascun soggetto saranno prelevate le ossa del metacarpo e metatarso dalla mezzena
destra (n = 36), che saranno conservate sottovuoto e congelate per essere inviate all'UR di Campobasso, per la valutazione dei
parametri morfometrici (lunghezza, diametro diafisario massimo, peso e umidità) e dello spessore della cartilagine di
accrescimento metacarpale.
Immediatamente dopo la preparazione della carcassa saranno prelevati da ciascun soggetto campioni di grasso perirenale, che saranno immediatamente congelati sotto vuoto e avvolti in foglio di alluminio, per essere inviati all'UR di Catania,
per l'effettuazione dei rilievi spettrofotometrici e delle analisi dei terpeni.Quindi, dopo 24 ore di refrigerazione, in corrispondenza della sezione trasversale tra i muscoli longissimus thoracis e lumborum, saranno rilevati in triplo: il pH
(mediante pHmetro portatile dotato di elettrodo ad infissione e sonda per il rilevamento della temperatura), il colore (coordinate
L*,a* e b*, sistema CIELAB, utilizzando un colorimetro portatile Minolta).
Dopo il periodo di refrigerazionela spalla destra di 8 soggetti (scelti tra i più rappresentativi di ciascuna tipologia ed il più
possibile omogenei tra loro) sarà separata secondo la procedura A.S.P.A. (1991. op. cit.) e spolpata per valutare l'incidenza delle
frazioni di magro, grasso e osso. In attesa dello spolpo, la spalla sarà conservata sottovuoto a -20°C.

I campioni di carne per le analisi qualitative effettuate dalle diverse UURR saranno prelevati dopo 24 h dalla macellazione, confezionati sottovuoto e congelati a -20°C, immediatamente o
dopo 6 giorni di refrigerazione (in base al tipo analisi alla quale saranno sottoposti).
I campioni verranno inviati alle UURR di competenza.
Alla UR di Firenze dovranno arrivare i campioni di sangue prelevati dagli agnelli immediatamente prima della macellazione per la
caratterizzazione genetica.
Ciascuna UR invierà i propri campioni di carne e di alimenti zootecnici alle altre, adottando gli accorgimenti necessari a preservare
la catena del freddo, per sottoporli ad analisi secondo quanto previsto dallo schema generale del progetto.
La fase 2 sarà dedicata alle analisi fisico-sensoriali e chimico-bromatologiche dei campioni di carne e di alimenti zootecnici, in
modo da:
a) fornire una approfondita caratterizzazione nutrizionale ed organolettica della carne prodotta dalle varie tipologie di
agnello;
b) verificare l'autenticità dell'origine genetica, geografica e dell'alimentazione degli agnelli prodotti;
c) caratterizzare geneticamente le razze. Ciascuna delle UURR effettuerà le analisi di competenza. Fa eccezione il consumer test, che ogni UR
effettuerà esclusivamente sui campioni di carne provenienti dalle proprie tipologie, sotto il coordinamento della UR di Udine, e
secondo la metodologia del central location test.
Oltre ai campioni di sangue degli agnelli, la UR di Firenze, utilizzerà campioni di sangue e/o di vello (comprensivo di bulbi piliferi) provenienti da ogni UR (40-50 per razza)per la caratterizzazione genetica.
Tali campioni dovranno provenire da riproduttori maschi e
femmine appartenenti ad almeno 5 allevamenti rappresentativi per ogni razza.
Si suggerisce l'utilizzazione di 6/8 pecore ed 1/2 arieti non fratelli pieni per ogni azienda.
Per l'estrazione del DNA dai campioni di sangue saranno utilizzati kit commerciali dedicati; per quelli di pelo metodologie manuali
standard.
Per rivelare il livello di polimorfismo entro e tra le razze studiate saranno analizzati 15 loci microsatelliti. Tali loci sono stati scelti tra quelli utilizzati dall'ISAG (International Society for Animal Genetics), per effettuare test di paternità, e sono divisi in due pannelli multiplexabili.
Di seguito la descrizione dei locus con le relative condizioni di amplificazione.
Multiplex 1: CSRD0247 - HSC – INRA0063 – MAF0214 – OarAE0129 – OarCP0049 – OarFCB0011 – OarFCB0304; Multiplex 2:
D5S2 - INRA0005 – INRA0023 – MAF0065 – McM0527 – OarFCB0020 – SPS0113 (proposed by Laboratorio Gruppi Sanguigni,
LGS Cremona).
Locus Primer sequences Dye
CSRD0247 GGA CTT GCC AGA ACT CTG CAA T HEX
CAC TGT GGT TTG TAT TAG TCA GG
HSC CTG CCA ATG CAG AGA CAC AAG A 6'FAM
GTC TGT CTC CTG TCT TGT CAT C
INRA0063 GAC CAC AAA GGG ATT TGC ACA AGC 6'FAM
AAA CCA CAG AAA TGC TTG GAA G
MAF0214 AAT GCA GGA GAT CTG AGG CAG GGA CG TET
GGG TGA TCT TAG GGA GGT TTT GGA GG
OarAE0129 AAT CCA GTG TGT GAA AGA CTA ATC CAG TET
GTA GAT CAA GAT ATA GAA TAT TTT TCA ACA CC
OarCP0049 CAG ACA CGG CTT AGC AAC TAA ACG C HEX
GTG GGG ATG AAT ATT CCT TCA TAA GG
OarFCB0011 GCA AGC AGG TTC TTT ACC ACT AGC ACC 6'FAM
GTG GGG ATG AAT ATT CCT TCA TAA GG
OarFCB0304 CCC TAG GAG CTT TCA ATA AAG AAT CGG HEX
CGC TGC TGT CAA CTG GGT CAG GG
Multiplex 2
Locus Primer sequences Dye
D5S2 TAC TCG TAG GGC AGG CTG CCT G 6'FAM
GAG ACC TCA GGG TTG GTG ATC AG
INRA0005 GTC CAT TGC CTC AAA TCA ATT C HEX
AAA CCA CTT GAC TAC TCC CCA A
INRA0023 GAG TAG AGC TAC AAG ATA AAC TTC TET
TAA CTA CAG GGT GTT AGA TGA ACT C
MAF0065 AAA GGC CAG AGT ATG CAA TTA GGA G TET
CCA CTC CTC CTG AGA ATA TAA CAT G
McM0527 GTC CAT TGC CTC AAA TCA ATT C HEX
AAA CCA CTT GAC TAC TCC CCA A
OarFCB0020 GGA AAA CCC CCA TAT ATA CCT ATA C 6'FAM
AAA TGT GTT TAA GAT TCC ATA CAT GTG
SPS0113 AAA GTG ACA CAA CAG CTT CTC CAG 6'FAM AAC GAG TGT CCT AGT TTG GCT GTG
CONDIZIONI DI AMPLIFICAZIONE
Multiplex 1
DNA 100 ng
Buffer 10X 1 microlitri
MgCl2 (25 mM) 1,2 microlitri
DNTPs (10 mM) 0,4 microlitri
Taq Gold (5U/ microlitri) 0,4 microlitri
Primers (10 micromoli):
CSRD247 0,4 + 0,4 microlitri
HSC 0,3 + 0,3 microlitri
INRA0063 0,2 + 0,2 microlitri
MAF0214 0,5 + 0,5 microlitri
OarAE0129 0,2 + 0,2 microlitri
OarCP0049 0,05 + 0,05 microlitri
OarFCB0011 0,15 + 0,15 microlitri
OarFCB0304 0,3 + 0,3 microlitri
In a total volume of 10 microlitri
In a total volume of 10 microlitri
PROGRAMMA DI AMPLIFICAZIONE
95°C x 12' 31 x (95°C x 20" - 63°C x 1' - 72°C x 1'
Multiplex 2
DNA 100 ng
Buffer 10X 1 microlitri
MgCl2 (25 mM) 1,2 microlitri
DNTPs (10 mM) 0,4 microlitri
Taq Gold (5U/ microlitri) 0,4 millilitri
Primers (10 micromoli):
D5S2 0,2 + 0,2 microlitri
INRA0005 0,3 + 0,3 microlitri
INRA0023 1,0 + 1,0 microlitri
MAF0065 0,4 + 0,4 microlitri
McM0527 0,2 + 0,2 microlitri
OarFCB0020 0,4 + 0,4 microlitril
SPS0113 0,1 + 0,1 microlitri
Volume totale 10 microlitri
PROGRAMMA DI AMPLIFICAZIONE
95°C x 10' 31 x (94°C x 30" - 55°C x 30" - 72°C x 1'
Caratteristiche Dei Locus
MULTIPLEX 2 range di dimensione
CSRD0247 209 - 261
HSC 267 - 301
INRA0063 169 - 207
MAF0214 181 - 265
OarAE0129 135 - 165
OarCP0049 82 - 140
OarFCB0011 122 - 148
OarFCB0304 148 - 190
MULTIPLEX 2 range di dimensione
D5S2 190 - 210
INRA0005 120 - 180
INRA0023 201 - 219
MAF0065 121 - 159
McM0527 165 - 179
OarFCB0020 92 - 118
SPS0113 130 - 158
Le regioni amplificate saranno poi analizzate con un sequenziatore capillare per ottenere il numero e la dimensione degli alleli
presenti nelle razze oggetto di studio.
L'analisi statistica riguarderà:
Analisi della varianza molecolare (AMOVA) per ottenere informazioni sulla struttura della variabilità entro e tra popolazioni
Test per la differenziazione genotipica esatta, analisi delle frequenze alleliche. Estimatori classici di variabilità quali F- statistico di Wright (FST) e l'indice "teta" di Weir & Cockerham (1984).
Inoltre si prenderanno in considerazione vari indici di similarità/diversità tra popolazioni; tra i diversi proposti si è scelto di utilizzare i seguenti indici di distanza genetica:
Sanghvi's distance (1953).
Cavalli Sforza e Edwards's distance (1967)
Nei Standard's distance (1972)
Nei's Minimum distance (1973).
Nei s Da distance (revisionata 1983).
Reynolds's distance (1983)
Golstein's distance (1995)

Le distanze genetiche si sono rivelate uno strumento molto potente per fare inferenze di tipo filigenetico-evolutivo e quindi per la
costruzione di dendrogrammi o alberi genetici che descrivano graficamente l'attuale stato della struttura e della storia evolutiva
delle popolazioni. I metodi con cui saranno calcolati tali dendrogrammi saranno quelli del neighbour-joining e della massima
parsimonia.

Inoltre verrà analizzata la probabilità di appartenenza di un individuo ad una popolazione con metodi basati sul genotipo
multilocus, per verificare indirettamente eventuali flussi genici tra le popolazioni studiate. Per queste analisi si utilizzeranno sia
degli algoritmi Bayesiani sia frequenze di likelihood e la probabilità di assegnazione genotipica basata sulle distanze
genetiche.
Infine si effettuerà un'analisi della diversità totale del set di razze oggetto di studio utilizzando come parametro base la ricchezza
allelica al posto dei più comuni estimatori come eterozigosi e numero di loci polimorfici. Il risultato è quello di considerare l'unicità della popolazione studiata in termini di patrimonio allelico evidenziando il livello di biodiversità reale apportato all'insieme delle popolazioni.
Il calcolo di questo estimatore si basa sull'analisi dei seguenti parametri:
Diversità entro popolazione (Hs)
Diversità totale (Ht).
Coefficiente di differenziazione genica (Gst)
Divergenza dalle altre popolazioni (DHs, DHt, DGst).
Contributo alla ricchezza allelica totale (Crt).