RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

SINTESI E CARATTERIZZAZIONE FARMACOLOGICA DI NUOVE MOLECOLE SELETTIVE PER IL RECETTORE BENZODIAZEPINICO PERIFERICO UTILI PER LA MODULAZIONE DELLA NEUROSTEROIDOGENESI, PER LA DIAGNOSI DI MALATTIE NEURODEGENERATIVE E PER IL DIREZIONAMENTO DI FARMACI ANTITUMORALI

Università di riferimento

Università degli Studi di CAGLIARI - BIOLOGIA SPERIMENTALE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Enrico Sanna

Descrizione

Il compito dell’Unità di Ricerca di Cagliari sarà quello di valutare l’attività biologica di una nuova serie potenziali ligandi ad alta affinità e selettività per il PBR. In particolare, verranno caratterizzati gli effetti di derivati imidazopiridinici, ottenuti apportando nuove sostituzioni con gruppi polari o ionizzabili in posizione 2 e 8 della struttura base imidazopiridinacetammidica. Tutti questi composti saranno sintetizzati e inizialmente caratterizzati per le loro proprietà chimico-fisiche dall’Unità di Ricerca di Bari. In particolare, il nostro studio sull’attività biologica di queste molecole comprenderà le seguenti fasi:

FASE 1. Analisi della capacità di legame (binding) delle molecole con il recettore periferico per le benzodiazepine (PBR).
Si studierà la capacità delle molecole in esame di interagire e quindi competere per il PBR marcato con radioligandi selettivi come [3H]-PK 11195 e [3H]-CB34. La misurazione del binding specifico di questi radioligandi sarà effettuato in preparazioni di corteccia cerebrale e ovario di ratto. Mediante curve di inibizione con concentrazioni delle molecole comprese tra 10-9 e 10-4 M, si otterranno così informazioni sull’affinità di ciascun composto per il PBR. L’affinità di queste molecole sarà comparata con quella dei ligandi selettivi per il PBR, come il PK11195 e il CB34. (Tempo previsto: 4 mesi).

FASE 2. Analisi della capacità di legame delle molecole con il recettore centrale per le benzodiazepine e effetti modulatori sulla funzione dei recettori GABA-A.
Dal momento che alcuni composti imidazopiridinici, come zolpidem e alpidem, possiedono affinità sia per il PBR sia per il CBR, la ricerca di questa fase dovrà esaminare la selettività dei composti per il PBR valutando la capacità delle molecole di interagire con il recettore centrale per le benzodiazepine.
Il recettore centrale per le benzodiazepine verrà marcato con [3H]-flunitrazepam, e lo studio di binding verrà effettuato in preparazioni di corteccia cerebrale di ratto. Verranno utilizzate concentrazioni di ciascuna molecola comprese tra 10-9 e 10-4 M alfine di testare la loro capacità di inibire competitivamente il legame specifico del [3H]-flunitrazepam. Verrà inoltre applicata un’analisi elettrofisiologica (voltage-clamp) per valutare gli effetti modulatori delle molecole sulla funzione di recettori GABA-A. In particolare, verranno espressi in oociti di Xenopus laevis recettori GABA-A umani ricombinanti formati dalle subunità alfa1-beta2-gamma2, che costituiscono il sottotipo di recettore GABA-A più diffuso nel SNC dei mammiferi. Le correnti al Cl- indotte dal GABA saranno misurate in assenza o in presenza di concentrazioni crescenti (10-7 – 10-4 M) delle singole molecole. Gli effetti di queste molecole saranno comparati con quelli indotti da noti ligandi selettivi per il PBR, come il PK11195 e il CB34, e per il CBR, come le benzodiazepine lorazepam e l’imidazopiridina zolpidem. (Tempo previsto: 6 mesi).
Obiettivi intermedi di queste 2 fasi della ricerca:
Identificazione di nuove molecole imidazopiridiniche con elevata affinità e selettività per il PBR. Si noti che, la possibilità di riscontrare che alcuni derivati imidazopiridinici sintetizzati posseggano una certa attività sul CBR potrebbe risultare rilevante da un punto di vista farmacologico ed essere ulteriormente approfondita nell’ambito di altri progetti in quanto questo particolare aspetto è al di fuori degli obiettivi della presente ricerca.

FASE 3. Valutazione elettrofisiologica dell’azione delle nuove molecole imidazopiridiniche sull’attività di canali ionici mitocondriali associati al PBR.
In questa fase, le molecole che hanno superato lo screening preliminare effettuato dall’Unità di Bari e dalla nostra Unità, saranno testate più in dettaglio per quanto concerne la loro azione sul PBR. A tal scopo, l’azione dei suddetti composti verrà testata direttamente sulla funzionalità del PBR. Come descritto da Kinnally et al. (PNAS, 90:1374-1378, 1993), il complesso multiproteico contenente il PBR è strettamente associato, a livello della membrana interna mitocondriale, a due tipi di canali ionici denominati “mithocondrial centum picosiemens” (mCtS) e “multiple conductance channel” (MCC). Questi Autori hanno mostrato come ligandi ad alta affinità per il PBR siano in grado di indurre delle alterazione della funzione di questi due canali ionici. Perciò, queste alterazioni funzionali dei canali ionici forniscono un indice dell’attività delle molecole sul PBR. Applicando la metodica elettrofisiologica del patch clamp direttamente su mitoplasti o su frammenti di membrane mitocondriali, è possibile valutare l’effetto modulatorio dei ligandi per il PBR sulle correnti ioniche attraverso i suddetti canali ionici. Le registrazioni delle correnti passanti per un singolo canale verranno pertanto misurate con la configurazione “single channel” del patch clamp. La frequenza e la durata di apertura de canali verranno valutate in presenza o assenza dei nuovi composti che hanno precedentemente mostrato affinità per il PBR. Verrà valutata la capacità di queste molecole nel modulare (positivamente o negativamente) l’attività dei canali ionici mCtS e MCC in comparazione con quella di noti modulatori del PBR. Le molecole verranno testate usando un’ampia gamma di concentrazioni (10-9 – 10-4 M), in modo da costruire curve concentrazione-risposta complete che potranno permettere la determinazione della loro azione (efficacia e potenza) sul PBR.

FASE 4. Valutazione degli effetti delle molecole attive sul PBR sulla sintesi di steroidi.
Questo aspetto verrà valutato in vivo, nel ratto, in cui saranno misurati i livelli plasmatici e cerebrali di steroidi in seguito alla somministrazione i.p. delle diverse molecole.
a) Trattamento in vivo dei ratti.
Ratti maschi Sprague-Dawley verranno trattati con diverse dosi (determinate in esperimenti preliminari) delle diverse molecole in esame, e a tempi differenti (determinati in esperimenti preliminari) verranno sacrificati mediante decapitazione con la ghigliottina, per l’analisi degli steroidi nel plasma, o mediante irradiazione con microonde (per 4 secondi) focalizzate sul cranio, per la misurazione dei livelli cerebrali. Quest’ultima forma di sacrificio determina l’istantanea inattivazione degli enzimi nel tessuto cerebrale bloccando così il metabolismo degli steroidi dopo la morte dell’animale.
b) Estrazione e misurazione dei livelli di steroidi
Gli steroidi verranno estratti dai neuroni in coltura o dal cervello dei ratti trattati, con etile acetato e purificati su cartucce Seppak-silice. Gli steroidi verranno ulteriormente purificati e separati mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) su colonne lichrosorb-diol sviluppate con un gradiente discontinuo di 2-propanolo in esano. La misurazione dei singoli steroidi sarà effettuata mediante dosaggio radioimmunologico con anticorpi specifici sul contenuto delle corrispondenti frazioni ottenute dal frazionamento con HPLC. Gli steroidi verranno estratti dal plasma dei ratti trattati con etile acetato e misurati direttamente mediante dosaggio radioimmunologico come descritto sopra.
La potenziale azione agonista dei diversi composti verrà valutata sulla base della loro capacità di stimolare la sintesi di steroidi, in comparazione con l’azione di ligandi selettivi per il recettore periferico per le benzodiazepine, come il PK 11195 o il CB34. L’azione antagonistica o inibitoria sulla sintesi di steroidi verrà valutata sia in condizioni basali che in seguito a stimolazione con PK 11195 o CB34. (Tempo previsto: 1 anno).

FASE 5. Valutazione degli effetti neurosteroide-mediati sulla funzione dei recettori GABA-A in neuroni in fettina di ippocampo di ratto.
Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato (Sanna et al., J. Neuroscience, 24:6521-6530, 2004) che la perfusione delle fettine di ippocampo di ratto con l’agonista del PBR CB34 provoca un aumento significativo dell’ampiezza e del tempo di decadimento delle correnti postsinaptiche inibitorie in miniatura (mIPSC) mediate dal recettore GABA-A nei neuroni piramidali dell’area CA1. Dal momento che la finasteride, che inibisce la formazione di allopregnanolone, previene l’azione del CB34, questo effetto sulla funzione dei recettori GABA-A sembra mediato dalla capacità del CB34 di stimolare la formazione locale di neurosteroidi. Questo modello in vitro è quindi utile per valutare ulteriormente gli effetti dei composti in esame e attivi sul PBR sulla produzione di neurosteoridi.
Registrazione elettrofisiologica in neuroni di ippocampo in fettina di tessuto con la tecnica del patch clamp.
Le fettine di ippocampo (300 um) verranno preparate da ratti maschi Sprague-Dawley di 14-21 giorni utilizzando un vibratomo. Mediante un microscopio ad infrarossi, le singole cellule piramidali dello strato CA1 dell’ippocampo verranno visualizzate e studiate con la tecnica del patch clamp in configurazione whole cell che permette la misurazione delle IPSC in miniatura o evocate sinapticamente. Le fettine verranno perfuse per 30 min con il composto in esame, durante i quali le mIPSC o le eIPSC saranno registrate a intervalli di 10 min, per periodi di 3 min. In esperimenti di controllo, alfine di valutare il ruolo della neurosteroidogenesi negli effetti osservati, la finasteride verrà perfusa per almeno 10 prima di essere perfusa insieme al composto in esame. Verranno analizzati diversi parametri tra i quali l’ampiezza, la frequenza e il tempo di decadimento delle correnti registrate. (Tempo previsto: 10 mesi).
Obiettivi finali di queste 3 fasi della ricerca:
Individuazione e caratterizzazione di molecole imidazopiridiniche ad alta affinità e selettività per il recettore periferico per le benzodiazepine dotate di azione di agonista (capaci di stimolare) o di antagonista (capaci di inibire) della steroidogenesi.