RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Studio dei mosaici recettoriali a livello dei gangli della base: implicazioni fisiopatologiche e terapeutiche

Università di riferimento

Università degli Studi di BRESCIA - SCIENZE BIOMEDICHE E BIOTECNOLOGIE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Maria Cristina Missale

Descrizione

Risultati preliminari
L’osservazione che nel SNC sono presenti popolazioni neuronali nelle quali i recettori D1 e D3 per la dopamina sono co-espressi e funzionalmente correlati (34, 35), ha suggerito che queste due proteine potrebbero essere in grado di interagire fisicamente formando un complesso recettoriale eterodimerico. Per confermare questa ipotesi, abbiamo effettuato esperimenti di co-immunoprecipitazione e Western blot su estratti proteici di cellule HEK293 co-transfettate con vettori di espressione contenenti le sequenze dei recettori D1 e D3. I risultati ottenuti hanno suggerito che esiste una interazione diretta di tipo proteina-proteina tra i due recettori. Inoltre, utilizzando la tecnica della misurazione del trasferimento di energia di risonanza biolumunescente (BRET) in cellule HEK293, abbiamo dimostrato in modo inequivocabile l’esistenza di un complesso recettoriale eterodimerico costituito dai recettori D1 e D3. Questi risultati suggeriscono quindi che i recettori D1 e D3 hanno la potenzialità di interagire anche nel SNC. Sono stati quindi effettuati studi di co-immunoprecipitazione in estratti proteici di striato ventrale di ratto dove i recettori D1 e D3 sono fisiologicamente co-espressi (35) e i risultati ottenuti hanno confermato che anche in vivo i recettori D1 e D3 interagiscono e formano un complesso eterodimerico.

Razionale
Recentemente abbiamo dimostrato che nei neuroni striatali della via diretta il recettore D1 forma un complesso oligomerico con il recettore glutamatergico NMDA e che alterazioni in questo complesso sono riscontrabili in modelli animali di malattia di Parkinson e di discinesie da L-DOPA (19, 20, 27). E’ importante inoltre sottolineare che negli stessi modelli sperimentali è stata osservata l’induzione aberrante dell’espressione del recettore D3 nei neuroni striatali della via diretta (31, 32, 36). E’ quindi possibile che, in queste condizioni patologiche, i recettori D1, D3 e NMDA modulino l’attività dei neuroni striatali della via diretta sia formando due eterodimeri, D1/D3 e D1/NMDA, con proprietà trasduzionali peculiari, che formando un mosaico recettoriale D1/D3/NMDA con proprietà funzionali e farmacologiche diverse da quelle dei singoli recettori e dei più semplici aggregati eterodimerici. La presenza del recettore D3 in popolazioni neuronali che fisiologicamente non lo esprimono e la sua interazione con il complesso D1/NMDA potrebbero quindi rivestire un ruolo importante nei meccanismi molecolari responsabili dei disordini del movimento. Lo studio delle caratteristiche funzionali del complesso recettoriale D1/D3 e le sue relazioni con il complesso recettoriale D1/NMDA possono quindi fornire una migliore comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la trasmissione dopaminergica nei gangli della base sia in condizioni fisiologiche che in condizioni patologiche.

Obiettivi.
Gli obiettivi di questo studio sono:
1. Definire le caratteristiche molecolari, funzionali e farmacologiche del complesso recettoriale D1/D3. In particolare si determineranno: 1) l’effetto degli agonisti sulla formazione dell’eterodimero; 2) il profilo farmacologico del complesso D1/D3; 3) la trasduzione del segnale attivata dal complesso D1/D3; 4) i meccanismi di desensitizzazione di questo complesso.
2. Definire la localizzazione neuronale e le caratteristiche (trasduzione del segnale e trafficking) del complesso D1/D3 nei modelli sperimentali di malattia di Parkinson e di discinesie da L-DOPA.
3. Definire le modalità di interazione tra i recettori D1, D3 e NMDA nei modelli sperimentali di malattia di Parkinson e di discinesie e in sistemi di cellule transfettate.
Lo studio si articolerà nelle seguenti fasi:

Primo anno
Fase 1. Studio delle caratteristiche molecolari e funzionali del complesso recettoriale dimerico D1/D3.
La caratterizzazione molecolare e funzionale del complesso D1/D3 verrà effettuata in cellule HEK293 stabilmente transfettate con i due recettori. In questa fase dello studio si valuteranno in particolare: il profilo farmacologico del complesso D1/D3, la trasduzione del segnale attivata da questo complesso, l’effetto degli agonisti sulla formazione del dimero e i meccanismi di desensitizzazione di questo complesso.
Studio del profilo farmacologico del complesso D1/D3.
Poiché la formazione di complessi eterodimerici può modificare l’affinità e le caratteristiche farmacologiche dei recettori che li costituiscono, si valuterà se l’interazione tra il recettore D1 e il recettore D3 dà origine a una nuova entità molecolare con caratteristiche di legame e profilo farmacologico peculiari. Le proprietà del complesso D1/D3 verranno quindi definite in studi di binding radiorecettoriale utilizzando i ligandi radioattivi [3H]SCH23390, selettivo per il recettore D1, e [3H]7-OH-DPAT selettivo per il recettore D3. In particolare, gli esperimenti verranno effettuati su membrane ottenute da cellule che esprimono il solo recettore D1, il solo recettore D3 o il complesso recettoriale D1/D3. Per valutare l’affinità dei siti di legame gli esperimenti di binding verranno eseguiti con diverse dosi di ligandi marcati e i risultati verranno valutati con l’analisi di Scatchard. Il profilo farmacologico dei siti verrà valutato in esperimenti di competizione con farmaci agonisti e antagonisti specifici selezionati. La affinità di ogni farmaco per il complesso D1/D3 verrà paragonata alla affinità per il corrispondente recettore espresso singolarmente.
Studio della trasduzione del segnale attivata dal complesso D1/D3.
Nello stesso modello cellulare verranno studiate le vie di trasduzione del segnale attivate dal complesso eterodimerico D1/D3 per valutare se la dimerizzazione comporta sinergismi o anomalie nell’attivazione delle principali vie intracellulari associate a questi recettori.
Il recettore D1 è associato alla stimolazione della adenilico ciclasi, alla attivazione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti (soprattutto i canali di tipo L e N) e alla attivazione delle ERK (chinasi attivate da segali extracellulari), mentre il recettore D3 inibisce in modo specifico l’adenilico ciclasi di tipo V, inibisce le correnti al calcio di tipo N (6) e attiva le ERK (38). Si valuterà quindi l’effetto della co-stimolazione dei recettori D1 e D3 sulla formazione di AMP ciclico, sull’attività dei canali del calcio voltaggio-dipendenti e sulla attivazione delle ERK. In particolare, si studieranno gli effetti della dopamina e di agonisti selettivi per il recettore D1 (SKF 81297) o per il recettore D3 (quinpirolo), somministrati singolarmente o in associazione, sull’attività dell’adenilico ciclasi, sia in condizioni basali che in condizioni di stimolo con forskolin, nelle cellule HEK293 contenenti i recettori D1 e D3 e transfettate con l’adenilico ciclasi di tipo V. I risultati di questi esperimenti verranno confermati utilizzando la linea cellulare neuronale SY5Y, che esprime elevati livelli di adenilico ciclasi V endogena, transfettate con i recettori D1 e D3. Nelle stesse condizioni sperimentali verrà valutata l’attività dei canali per il calcio voltaggio-dipendenti, misurando i flussi di [45Ca2+], in assenza e in presenza di antagonisti specifici per i canali di tipo L (nifedipina) e di tipo N (Cd2+). L’attività delle ERK verrà analizzata nelle cellule di controllo e trattate con diverse combinazioni degli agonisti misurandone il grado di fosforilazione in esperimenti di Western Blot utilizzando anticorpi specifici per le forme fosforilate di queste proteine. L’attivazione delle ERK verrà determinata a tempi diversi (2 min-1 ora) per valutarne la durata. La localizzazione cellulare delle ERK fosforilate verrà valutata nelle stesse condizioni sperimentali con la tecnica della immunofluorescenza associata alla microscopia confocale.
Studio degli effetti degli agonisti sulla formazione dell’eterodimero D1/D3.
Poiché l’interazione tra diversi GPCR può essere costitutiva o dipendente dagli agonisti, in questa fase dello studio valuteremo l’effetto di diverse combinazioni di agonisti (SKF 81297, quinpirolo, SKF 81297 + quinpirolo, dopamina) sulla formazione del complesso D1/D3 utilizzando la tecnica della BRET come descritto precedentemente (19).
Studio dei meccanismi di desensitizzazione del complesso D1/D3.
I recettori D1 e D3, che sono normalmente localizzati a livello delle membrane cellulari, hanno dimostrato differenti proprietà adattative alla stimolazione prolungata con gli agonisti. Dati presenti in letteratura indicano infatti come il recettore D3, a differenza del recettore D1 e degli altri recettori dopaminergici, sia caratterizzato da una minore capacità di internalizzare in risposta alla stimolazione prolungata con gli agonisti (39). L’interazione recettoriale D1/D3 potrebbe quindi conferire al recettore D1 o al recettore D3 caratteristiche differenti nei meccanismi che ne regolano la desensitizzazione. Questo aspetto verrà studiato nelle cellule HEK293 contenenti i recettori D1 e D3 da soli o in associazione, in differenti condizioni di attivazione recettoriale. In particolare le cellule verranno trattate per periodi prolungati (1-3 ore) con la dopamina o gli agonisti selettivi SKF 81297 e quinpirolo da soli e in associazione e la localizzazione cellulare dei complessi recettoriali verrà valutata utilizzando la tecnica della immunofluorescenza associata alla microscopia confocale in collaborazione con il gruppo di Agnati (Unità 2 di questo progetto).

Secondo anno
Fase 2 Studio della localizzazione neuronale del complesso recettoriale D1/D3 nello striato nei modelli sperimentali di malattia di Parkinson e di discinesie da L-DOPA.
I recettori D1 hanno un’ampia distribuzione nei neuroni striatali. Sono stati infatti identificati a livello del corpo cellulare, dei dendriti e delle spine dendritiche dove sono localizzati sia nelle densità postsinaptiche (PSD) delle sinapsi glutamatergiche (19), che a livello extrasinaptico. La localizzazione cellulare dei recettori D3 è stata molto meno caratterizzata anche perché questo recettore è molto poco espresso nello striato dorsale in condizione fisiologiche. Per valutare il significato fisiopatologico dell’induzione del recettore D3 nei neuroni striatonigrali nei modelli animali di morbo di Parkinson e di discinesie da L-DOPA è importante definire i microdomini neuronali in cui i recettori D1 e D3 sono co-localizzati e possono interagire. Si studierà quindi, in esperimenti di Western blot, la localizzazione dei recettori D1 e D3 in differenti frazioni proteiche striatali, quali estratti totali, preparazioni di membrane cellulari, preparazioni arricchite in PSD e frazioni di membrane extrasinaptiche, preparate come descritto precedentemente (19, 27). La presenza del complesso D1/D3 nelle frazioni descritte verrà determinata in esperimenti di co-immunoprecipitazione. Lo studio verrà condotto in ratti di controllo e in modelli sperimentali di malattia di Parkinson (ratti con lesione monolaterale del fascio nigrostriatale, ottenuta mediante somministrazione stereotassica di 6-idrossidopamina) e di discinesie da L-DOPA (ottenute con la somministrazione cronica di basse dosi del farmaco), recentemente sviluppati e caratterizzati nel nostro laboratorio (27).
Poiché i complessi recettoriali D1/D3 regolano l’attività dei neuroni dello striato dorsale modulando specifiche vie trasduzionali, si valuteranno, nei modelli sperimentali descritti, l’efficienza delle vie di trasduzione del segnale collegate al complesso D1/D3 identificate nella fase 1 di questo studio.

Fase 3. Studio delle interazioni tra recettori D1, D3 e NMDA.
In questa fase dello studio si valuterà se il recettore D3, espresso in condizioni patologiche nei neuroni della via diretta dello striato dorsale, può essere coinvolto nella formazione di un mosaico recettoriale di ordine superiore contenente i recettori D1, D3 e NMDA.
A questo scopo esperimenti di co-immunoprecipitazione e Western blot verranno effettuati sia in preparazioni di membrane totali che di PSD di striato ottenute da ratti lesionati e/o discinetici per verificare se il recettore D3 co-immunoprecipita con i recettori D1 ed NMDA ed è direttamente coinvolto quindi nella formazione di un aggregato complesso contenente i tre recettori. Se questa ipotesi viene confermata, alcuni studi verranno successivamente intrapresi nelle cellule HEK293 contenenti i recettori D1 e D3 e transfettate in modo transiente con le subunità NR1 e NR2B del recettore NMDA per iniziare a caratterizzare alcuni aspetti funzionali e molecolari del mosaico recettoriale D1/D3/NMDA. In particolare si studieranno gli effetti degli agonisti sulla formazione del complesso D1/D3/NMDA in esperimenti di co-immunoprecipitazione e/o BRET e le caratteristiche di desensitizzazione del complesso in esperimenti di immunofluorescenza.

Rilevanza dello studio proposto

I risultati di questo studio forniranno una visione molto più approfondita, rispetto alle conoscenze attuali, della modulazione dell’efficacia della trasmissione dopaminergica a livello dei gangli della base, ad opera dei recettori D1, D3 e NMDA.

Definire l’esistenza e il ruolo funzionale di eterodimeri o di mosaici recettoriali più complessi contenenti i recettori D3, D1 e NMDA nei neuroni striatali della via diretta può inoltre aprire la strada allo sviluppo di approcci innovativi per la terapia del morbo di Parkinson e delle discinesie da L-DOPA. I mosaici possono infatti rappresentare un nuovo bersaglio per lo sviluppo di farmaci che ne regolino in modo dinamico la formazione o che modulino le funzioni dei complessi preformati.