RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Studio dei mosaici recettoriali a livello dei gangli della base: implicazioni fisiopatologiche e terapeutiche

Università di riferimento

Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA - SCIENZE BIOMEDICHE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Luigi Francesco Agnati

Descrizione

La ricerca sul trafficking recettoriale sarà condotta in cellule CHO stabilmente cotrasfettate con cDNA per il recettore A2A (A2AR) per l’adenosina, che presenta una doppia marcatura con emoagglutinina, per il recettore umano D2 (D2R) per la dopamina (forma lunga) e per il recettore mGlu5 (mGlu5R) per il glutammato.
Utilizzeremo tecniche d’immunocitochimica per valutare gli effetti dell’incubazione con agonisti ed antagonisti dei recettori del mosaico (per A2AR l’agonista CGS-21680 e l’antagonista MSX-3, per mGlu5R l’agonista CHPG e l’antagonista MPEP).
Tali esperimenti saranno effettuati sia in assenza sia in presenza di omocisteina (Hcy).
L’analisi al microscopio confocale sarà condotta su preparati di immunocitochimica nei quali si visualizzerà il recettore D2 (hub receptor) e/o la caveolina e/o la b-colera tossina secondo i parametri illustrati da Genedani (2005). L’analisi dell’immagine sarà effettuata tramite un programma specifico (Zeiss-Kontron 400.3). Un nuovo software messo a punto dal nostro gruppo sarà utilizzato per l’analisi quantitativa (Agnati et al, 2005).
Il nostro gruppo utilizza tecniche di analisi dell’immagine dal 1974 anno di pubblicazione dei primi dati sulla quantificazione di varicosità monoaminergiche visualizzate mediante la tecnica di Falck-Hillarp (Agnati e Fuxe, 1974). Nell’ultimo ventennio si è assistito ad una rapida evoluzione (Agnati e Fuxe 1984, 1985; Agnati et al, 2005) in seguito sia all’introduzione di nuove tecniche immunocitochimiche ed autoradiografiche capaci di visualizzare marker biologici, sia grazie allo sviluppo dei sistemi di acquisizione e di elaborazione delle immagini digitalizzate. L’analisi computerizzata dell’immagine dà un tipo di informazione diverso rispetto alla valutazione biochimica dello stesso marker. In particolare, si possono avere informazioni sulla forma d’immagazzinamento del marker, sulla localizzazione entro la struttura biologica e sulle relazioni spaziali rispetto ad altri marker presenti nello stesso substrato biologico. Inoltre, è da sottolineare, che la caratterizzazione quantitativa delle immagini è la tappa basilare per la valutazione statistica delle immagini ottenute da preparati biologici in diverse condizioni sperimentali. Infatti, la statistica è stata definita come lo studio scientifico di dati numerici basate sulle variazioni naturali (Sokal and Rohlf, 1981).
Per mezzo di questi metodi informatici è, quindi, possibile studiare l’effetto di varie condizioni sperimentali (Agnati e Fuxe 1984, 1985) su preparati biologici esaminati a diversi livelli di risoluzione. Infine tali metodologie permettono di definire obiettivamente termini biologici come cluster di recettori, pattern di distribuzione di recettori, relazioni spaziali tra recettori, ecc. che diversamente avrebbero solo un significato ambiguo ed intuitivo. La disponibilità di anticorpi verso i D2R, Caveolina 1 (CAV1) e subunità beta della tossina colerica (B-CT) rende possibile l’approccio sperimentale di seguito descritto. Nelle cellule CHO cotrasfettate con i recettori A2A/D2/mGlu5 saranno studiati:
1) La distribuzione dei D2R con immunofluorescenza (confocale) in cellule in assenza o presenza di Hcy (10-3, 10-5, 10-7, 10-9 M) prima e dopo trattamento con agonisti e/o antagonisti dei recettori del mosaico (per i A2AR l’agonista CGS-21680 e l’antagonista MSX-3, per i mGlu5R l’agonista CHPG e l’antagonista MPEP).
2) La colocalizzazione D2R/CAV1 con immunofluorescenza a doppia marcatura (confocale) in assenza o presenza di Hcy (10-3, 10-5, 10-7, 10-9 M) prima e dopo trattamento con agonisti ed antagonisti dei recettori del mosaico (per A2AR CGS-21680 e MSX-3, per mGlu5R CHPG e MPEP).
3) La colocalizzazione D2R/B-CT con immunofluorescenza a doppia marcatura (confocale) in assenza o presenza di Hcy (10-3, 10-5, 10-7, 10-9 M) prima e dopo trattamento con agonisti ed antagonisti dei recettori del mosaico (per A2AR CGS-21680 e MSX-3, per mGlu5R CHPG e MPEP).
La modulazione dell’efficacia della trasmissione dopaminergica a livello dei gangli della base mediata dai A2AR e/o dai mGlu5R sarà studiata in vivo utilizzando i seguenti protocolli sperimentali:
1) Il CGS-21680 (agonista degli A2AR) sarà iniettato tramite tecnica stereotassica in uno striato mentre l’MSX-3 (antagonista degli A2AR) verrà iniettato nello striato controlaterale. In questi animali si valuterà il rotational behaviour sia dopo la sola iniezione dei due farmaci che dopo somministrazione periferica di apomorfina o L-DOPA. L’attività della tiroxina idrossilasi (TH) in entrambi gli striati sarà determinata con metodo biochimico e tramite esperimenti di immunoistochimica.
2) Il CHPG (agonista dei mGlu5R) sarà iniettato tramite tecnica stereotassica in uno striato mentre l’MPEP (antagonista degli mGlu-5R) verrà iniettato nello striato controlaterale. In questi animali si valuterà il rotational behaviour sia dopo la sola iniezione dei due farmaci che dopo somministrazione periferica di apomorfina o L-DOPA. L’attività della TH in entrambi gli striati sarà determinata come sopra descritto.
3) L’influenza degli agonisti o antagonisti dei A2AR (CGS-21680 e MSX-3) e/o dei mGlu-5R (CHPG e MPEP), iniettati per via intraperitoneale, sarà valutata sulle discinesie indotte da iniezione di 6-OHDA nello striato e trattamento cronico con L-DOPA (10 mg/kg/i.p.) più benserazide (7.5 mg/kg) per 21 giorni. L’attività della TH in entrambi gli striati sarà determinata come sopra descritto.
4) Gli esperimenti descritti al punto 1, 2 e 3 saranno eseguiti anche in animali con iperomocisteinemia indotta o tramite iniezione intraperitoneale di Hcy (30 mg/kg/die) per 10 giorni oppure somministrando metionina (1 g/kg/die) disciolta nell’acqua da bere per 4 settimane.
Si procederà anche alla messa a punto di un modello matematico capace di simulare aspetti dell’elaborazione dell’informazione nel mosaico recettoriale, come illustrato negli obiettivi.

Metodologie utilizzate

1) esperimenti in vitro

Trasfezione di cellule CHO con cDNA per i recettori A2A e D2L
Cellule CHO verranno stabilmente transfettate con cDNA per il A2AR di cane con doppia marcatura di emoagglutinina (gentilmente fornito dal Dr. M. Olah, frammento di 1230 kb cDNA clonato in pcDNA/Hygro+, che conferisce resistenza all’igromicina), con lipefectAMINE (Life Technologies, Inc). Per la coespressione dei recettori HA-A2A e D2L, il cDNA per il recettore D2L umano per la dopamina (frammento di 2600 kb cDNA clonato in vettore Plxsn, che conferisce resistenza alla geneticina) sarà analogamente trasfettato in cellule CHO che esprimono stabilmente recettori A2A (linee cellulari A2A/D2), e saranno selezionati i cloni resistenti a geneticina e igromicina. Le stesse cellule saranno trasfettate con cDNA per il recettore mGlu5.
Colture di cellule CHO
Le cellule CHO (CHO-K1 cells; CCL61, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) saranno coltivate in medium a-MEM privo di nucleosidi, addizionato con siero fetale di vitello al 10%, penicillina (50 mg ml-1), streptomicina (50 mg ml-1), L-glutamina (2 mM) (300 mg ml-1) a 37 °C in presenza di CO2 al 5%. Come selettore dell’espressione dei recettori A2A si utilizzerà igromicina (300 mg ml-1) mentre la Geneticina (G-418) (400 mg ml-1) sarà usata come selettore specifico dell’espressione dei recettori D2L.
Immunocitochimica
a) Immunofluorescenza. Per le tecniche di immunofluorescenza le cellule verranno coltivate su vetrini (Chamber Slide Culture, Labtek/Nunc) coattati con poly-L-lysine (Sigma). Dopo lavaggio in PBS, le cellule saranno fissate per 20 min con paraformaldeide al 4%in tamponi fosfati (125 mM, pH 7.4) addizionato con sucrosio 0.06 M. Dopo lavaggio con PBS contenente glicina 20 mM e successivo trattamento con PBS/20 mM glycine/1% BSA per 30 minuti a temperatura ambiente, le cellule saranno incubate con l’anticorpo pimario rabbit anti-D2 antibody, rabbit anti-Caveolin 1 antibody (Santa Cruz Biotechnology) (1:1000), cholera toxin (Molecular Probes) (1:25)) a 4°C overnight in PBS, pH 7.4, supplementato con siero di capra all’ 1%. Dopo vari lavaggi si procederà all’incubazione con anticorpi secondari (anti-mouse, ant-rabbit) per 1 h a T ambiente. Dopo ulteriori lavaggi, I vetrini saranno montati con medium specifico per immunofluorescenza (30% Mowiol, Calbiochem).
Acquisizione delle immagini
Le osservazioni microscopiche saranno effettuate con microscopio confocale Leica TCS 4D (Leica Laser technik, Heidelberg, Germany) adattato ad un microscopio invertito Leica DMIRBE interfacciato con un laser argon-kripton settato ad una potenza di 8 mW per linea (488, 568, 647 nm) e operante in acquisizione simultanea.
Per minimizzare il rumore di fondo e ridurre al minimo il photobleaching, si utilizzerà un tempo di acquisizione 1s per scansione ed una media di 16 scansioni per produrre un’immagine di 512x512 pixel.
Tutte le immagini verranno acquisite con un obiettivo plan-apocromatico x100/NA 1.4. Si applicherà un campionamento di 80nm nel piano della sezione e 0.25 microm in direzione assiale, rispettando in tal modo il teorema di Nyquist.
Due immagini per cellula, con sezione ottica dello spessore di 0.25 microm saranno acquisite per l’analisi: le immagini fluorescenti in verde o rosso saranno direttamente acquisite tramite il microscopio laser.
Analisi d’immagine
Almeno dieci cellule per ogni condizione sperimentale saranno analizzate con l’analizzatore d’immagine KS 400 (Zeiss Kontron). Per la doppia immunofluorescenza, la discriminazione rosso/verde (RG) sarà eseguita su ogni singola cellula. L’area specifica (FA) sarà misurata assieme alla rispettiva intensità di marcatura (valore medi di grigio NGV). Si calcolerà l’immunoreattività totale (TIR) moltiplicando il valore di FA per il corrispondente valore di densità ottica (o per il MGV).
Di conseguenza, l’area di immunoreattività specifica in cui è presente la maggior emissione per entrambi i fluorofori verrà valutata tramite la funzione di “multiply”. Questa funzione permette la moltiplicazione delle due immagini pixel per pixel e divide i risultati per fattore (1,….255) per evitare la saturazione della intensità. Si elimineranno anche i pixel in cui uno dei due segnali ha intensità così ridotta da essere al di sotto di una soglia stabilita. Per mezzo di questa procedura saranno valutate, quindi, solamente le aree in cui i due fluorofori mostrano simultaneamente un’emissione elevata. L’area totale di immunoreattività ove si ha sovrapposizione dei due fluorofori sarà valutata usando l’operatore Booleano “AND” sulle due immagini (verde e rossa) discriminate tramite la procedura automatica precedentemente descritta (Agnati et al., 2005).


2) esperimenti in vivo
Effetti di agonisti ed antagonisti dei A2AR e/o mGlu5R
Si utilizzeranno ratti maschi Wistar (Harlan Italy) del peso di 200-250 g, mantenuti in condizioni di stabulazione e sperimentazione in accordo con la direttiva del Consiglio della Comunità europea del novembre 1986 (86/609/EEC). Negli animali anestetizzati con alitano, sarà impiantata, tramite stereotassico (da bregma: anteriore, 1.2 mm; laterale, -2.5emm; dorsale, -5.5 mm with respect to bregma, in accordo con l’atlante stereotassico di Paxinos e Watson), una cannula a permanenza in ambedue gli striati. Attraverso tali cannule saranno iniettati i diversi farmaci ciascuno in un volume totale di 500 nl. Si utilizzeranno agonisti ed antagonisti dei recettori del mosaico (per i recettori A2A l’agonista CGS-21680 e l’antagonista MSX-3, per i recettori mGlu5 l’agonista CHPG e l’antagonista MPEP). In questi animali si valuterà il rotational behaviour sia dopo la sola iniezione dei due farmaci che dopo somministrazione periferica di apomorfina (0.5 mg/kg s.c.) o L-DOPA.

Rotational behaviour
Il numero di giri completi (360°) compiuti dall’animale in 15 minuti, verrà valutato tramite un rotometro automatico. Prima dell’inizio della registrazione gli animali verranno lasciati nel rotometro per 15 minuti onde permettere l’adattamento al nuovo ambiente. Il rotational behavior verrà valutato nei diversi gruppi di animali come precedentemente descritto.

Effetti di agonisti ed antagonisti dei A2AR e/o mGlu5R sulle discinesie
Si utilizzeranno ratti maschi Wistar (Harlan Italy) del peso di 290-300 g, mantenuti in condizioni di stabulazione e sperimentazione in accordo con la direttiva del Consiglio della Comunità europea del novembre 1986 (86/609/EEC). Negli animali anestetizzati con cloralio idrato (400 mg/kg), sarà iniettata 6-OHDA 12 mg sciolta in 4 ml di soluzione fisiologica contenente acido ascorbico al 2%, ad una velocità di 0.38 microl/min nello striato sinistro tramite stereotassico (da bregma: anteroposteriore, -3.6; laterale, 1.9; dorsoventrale, -8.8).Due settimane dopo l’intervento chirurgico si valuterà il rotational behaviour indotto da una bassa dose di apomorfina (0.05 mg/kg i.p.). Solo gli animali che presenteranno un numero di rotazioni superiore a 200 in 40 minuti saranno utilizzati per la successiva sperimentazione. Gli animali selezionati saranno quindi trattati per via intraperitoneale con: a) CGS-21680 (0.25 mg/kg) b) MSX-3 (3 mg/kg) c) CHPG (1 mg/i.c.v.) d) MPEP (20 mg/kg) c) soluzione fisiologica più, a distanza di 30 minuti, L-DOPA (10 mg/kg/i.p.) più benserazide (7.5 mg/kg) per 5 o 21 gg.

Discinesie
Nei suddetti gruppi di animali si valuteranno 2 volte/settimana i movimenti involontari anomali (AIMs) 45 min dopo la somministrazione di L-DOPA per un periodo di 5 min per ciascun animale. Verranno registrati: 1) movimenti assiali 2) movimenti delle zampe 3) movimenti orolinguali 4) locomozione come descritto nel lavoro di Fiorentini et al (2006).

Immunoistochimica
Le sezioni ottenute tramite criostato (30 micrometri) a livello dello striato saranno incubate overnight con anticorpo primario anti-TH di topo (1:100, Chemicon, UK) e con anticorpo secondario anti-mouse marcato con Alexa Fluor 488 (1:100) per 1 h a T ambiente.

Modelli di iperomocisteinemia
Si utilizzeranno due diversi modelli di iperomocisteinemia. Nel primo protocollo si inietterà d/l-omocisteina per via intraperitoneale alla dose di 30 mg/kg due volte al giorno o soluzione fisiologica. Nostre precedenti ricerche hanno dimostrato che dopo 10-12 gg di trattamento le concentrazioni plasmatiche di Hcy sono 42.02±7.23 microM rispetto ad un valore di 5.63±0.39 negli animali non trattati con Hcy.
Nel secondo protocollo gli animali saranno trattati con metionina (1 g/kg/die) disciolta nell’acqua da bere o avranno libero accesso ad acqua. Nostre precedenti ricerche hanno dimostrato che dopo 30 gg di trattamento le concentrazioni plasmatiche di Hcy sono 7.58±0.23 microM rispetto ad un valore di 5.63±0.39 negli animali che hanno bevuto acqua non addizionata con metionina.

Rilevanza dei risultati che le ricerche proposte possono dare
I risultati della presente ricerca dovrebbero permettere di:

a) Dare una definizione operazionale di hub receptor (recettore “nodale”) termine che è di notevole rilevanza nella caratterizzazione delle reti molecolari (vedi anche Watts and Strogatz, 1998; Agnati et al, 2002). Questa definizione operazionale si potrebbe indagare se applicabile ad altri mosaici recettoriali con la possibilità di formulare rilevanti ipotesi euristiche.

b) Avere una visione più approfondita della modulazione dell’efficacia della trasmissione dopaminergica, a livello dei gangli della base, mediata dai recettori A2A e/o dai recettori mGlu5.

c) Valutare l’eventuale effetto della Hcy sulla modulazione dell’efficacia della trasmissione dopaminergica, a livello dei gangli della base, mediata dai recettori A2A e/o dai recettori mGlu5.


d) Caratterizzare i processi d’internalizzazione del mosaico recettoriale A2A/D2/mGlu5 in cellule CHO, in diverse condizioni sperimentali ed in particolare in presenza di Hcy.

e) Formulare un modello matematico capace di simulare aspetti dell’elaborazione dell’informazione nel mosaico recettoriale.