RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Individuazione di determinanti di folding e misfolding mediante mutagenesi sistematica

Università di riferimento

Università degli Studi di FIRENZE - SCIENZE BIOCHIMICHE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Fabrizio Chiti

Descrizione

Quest’unità di ricerca (UR) ha un'esperienza pluriennale nell’utilizzo di tecniche di ingegneria proteica per ricavare informazioni sul folding e sull’aggregazione. Il primo compito di questa UR sarà la progettazione di mutazioni specifiche per la produzione di singoli mutanti. Progetteremo un numero di mutazioni che ci permetteranno di studiare sia il processo di folding che quello di aggregazione. La mutazioni verranno selezionate sulla base dei seguenti fattori: la necessità di essere il più conservative possibili, di coprire l’intera lunghezza della sequenza di b2-m e le diverse regioni strutturali della proteina nativa, di coinvolgere sia i residui esposti al solvente che quelli nascosti nel nucleo idrofobico e, cosa più importante, devono essere in grado di alterare le velocità di folding ed aggregazione di b2-m in modo da apprezzare il coinvolgimento dei residui mutati nei due processi. La lista delle mutazioni selezionate sarà trasmessa all’UR di Pavia (M. Stoppini) in modo da poter esprimere e purificare i mutanti progettati. La UR di Pavia metterà questi mutanti a disposizione di tutte le unità di ricerca coinvolte in questo progetto.
Il secondo compito di questa UR consiste nella determinazione dei parametri termodinamici e cinetici di folding e di unfolding di b2-m. I mutanti saranno ricevuti nella loro forma purificata dall’UR di Pavia (M. Stoppini). Le stabilità conformazionali dei mutanti saranno determinate misurando le curve di unfolding indotto dal cloruro di guanidina (GdnHCl) in condizioni di equilibrio, usando la fluorescenza intrinseca di b2-m come sonda spettroscopica per seguire il processo di unfolding. Queste curve, acquisite per ogni mutante e per la proteina wild-type, permetteranno di determinare la variazione di energia libera di unfolding causata da ogni mutante. Un fluorimetro, disponibile in questa UR, verrà utilizzato a questo scopo. Un dicrografo circolare verrà eventualmente utilizzato nel caso in cui la spettroscopia di fluorescenza si riveli non adatta a fornire informazioni su determinati mutanti.
Le velocità di folding ed unfolding verranno determinate per ciascun mutante a diversi valori di concentrazione del cloruro di guanidina usando un dispositivo a flusso interrotto (stopped-flow) accoppiato ad un rilevatore di fluorescenza. Un dispositivo simile verrà eventualmente accoppiato al dicrografo per quei mutanti la cui fluorescenza non si riveli una sonda spettroscopica adatta. I dati termodinamici e cinetici dei mutanti e della proteina wild-type saranno combinati per determinare i valori phi di tutti i residui mutati a livello dello stato di transizione del folding e degli stati intermedi che continuano ad essere popolati dopo che la reazione ha raggiunto l’equilibrio.
Un terzo approccio di questa UR consiste nell’uso di tutti gli algoritmi sviluppati sino ad ora per determinare le velocità di aggregazione teoriche e/o le propensioni ad aggregare attese per ciascun mutante. Il confronto e le possibili discrepanze tra i dati teorici e quelli sperimentali (questi ultimi comunicati alle unità di ricerca di Pavia e Genova, guidate rispettivamente da M. Stoppini ed A. Relini) riveleranno non solo le regioni della sequenza o i residui che promuovono l’aggregazione, ma anche se il meccanismo di aggregazione richiede l’unfolding o il refolding di una certa porzione di struttura o piuttosto la formazione di aggregati non-amiloidi prima che si formino strutture amiloidi. Verranno dunque creati dei programmi in grado di lanciare questi algoritmi di calcolo.
Infine, data l’esperienza di questa UR nello studio del folding, dell’aggregazione proteica e dell’ingegnerizzazione di proteine, raccoglieremo i dati provenienti dalle altre unità e li integreremo in modo da poter determinare il meccanismo residuo specifico di aggregazione e folding della b2-m.