RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Individuazione di determinanti di folding e misfolding mediante mutagenesi sistematica

Università di riferimento

Università degli Studi di NAPOLI "Federico II" - CHIMICA ORGANICA E BIOCHIMICA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Leila Birolo

Descrizione

Nell’ambito del presente programma di ricerca, noi utilizzeremo per la caratterizzazione di mutanti della proteina patogena beta2-microglobulina strategie e conoscenze sviluppate nel corso dell’ultimo decennio presso il nostro gruppo di ricerca che si basano sull’applicazione delle tecniche avanzate di spettrometria di massa all’analisi conformazionale di proteine.
Inoltre, un punto centrale del nostro programma di ricerca sarà l’analisi dell’interazione della beta2-microglobulina con il collageno.
Nostro principale obiettivo sarà fornire l’apporto di strategie alternative e complementari per l’analisi conformazionale di mutanti della beta2-microglobulina che saranno preparati presso l’Unità di Pavia. Gli stessi mutanti saranno analizzati con altre metodologie presso le altre Unità, nella prospettiva che consideriamo questo approccio integrato particolarmente appropriato per affrontare problematiche ambiziose quali l’analisi di intermedi transienti in processi dinamici quali i cambi conformazionali o il misfolding, nonché per la definizione del core delle fibrille.
Gli intermedi transienti, infatti, sono specie molecolari termodinamicamente instabili e quindi difficili da analizzare. Per superare queste difficoltà, sono state sviluppate strategie integrate quali lo scambio H/D o la proteolisi limitata (LP) accoppiate alla spettrometria di massa (MS). [17, 21, 22]. La cinetica di scambio protone/deuterio in corrispondenza del legame ammidico dipende principalmente dall’accessibilità al solvente e dalla stabilità data dallo scheletro polipeptidico delle regioni della proteina coinvolte. Gli idrogeni ammidici forniscono quindi dei target per lo scambio con il deuterio lungo l’intera catena polipeptidica. Tuttavia, la velocità di scambio dipende in maniera determinante dalla localizzazione dei singoli amminoacidi; i protoni ammidici che si trovino in regioni altamente strutturate e coinvolte in legami idrogeno stabilizzanti la struttura scambieranno lentamente, mentre quelli presenti in regioni flessibili mostreranno cinetiche di scambio H/D veloci. Dato che l’analisi per massa è in grado di misurare l’aumento in massa associato con lo scambio, l’incorporazione di deuterio e le cinetiche di scambio H/D possono essere messe in relazione con cambi conformazionali delle proteine in soluzione durante il processo di folding/unfolding o in differenti condizioni sperimentali quali la formazione di complessi proteina-ligando (quale ad esempio la formazione del complesso beta2-m – collageno).
Analisi comparative di scambio H/D possono quindi rivelarsi utili per seguire cambi conformazionali delle proteine. Sebbene lo scambio H/D sia stato più frequentemente analizzato via NMR, l’analisi via spettrometria di massa sta diventando sempre più frequente. A tal proposito, la spettrometria di massa presenta inoltre il vantaggio rispetto all’NMR di essere in grado di evidenziare la presenza di più conformazioni presenti in miscela.
Inoltre, sebbene non si riesca mai a raggiungere la risoluzione molecolare dell’NMR, gli esperimenti di HD/MS possono anche fornire informazioni sulle singole regioni della catena polipeptidica. Successivamente allo scambio, la proteina marcata viene sottoposta a digestione proteolitica con pepsina in condizioni acide in modo da minimizzare lo scambio con i protoni e i frammenti generati vengono successivamente analizzate mediante cromatografia in fase liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS). I peptidi vengono identificati sulle base dei loro valori di massa unici ed in paragone con i frammenti che si generano dalla proteina non marcata. L’aumento dei valori di massa dei frammenti marcati è direttamente collegato al numero degli atomi di deuterio incorporati fornendo così informazioni sull’esposizione al solvente di specifiche regioni della proteina.
I cambi conformazionali delle proteine possono essere anche analizzati mediante proteolisis limitata in una strategia integrata con l’analisi mediante spettrometria di massa (LP/MS). La base razionale di questo approccio, consiste nel fatto che la struttura tridimensionale delle proteine offre una barriera stereochimica agli attacchi proteolitici, lasciando accessibili alle proteasi solo le regioni esposte e flessibili. Quando questi esperimenti si effettuano con una serie di proteasi con diversa specificità, seguiti da un analisi mediante spettrometria di massa, il pattern dei siti proteolitici preferenziali rende possibile la definizione delle regioni esposte nella molecola proteica. I cambi conformazionali che avvengono nella struttura proteica nel corso del processo del folding possono essere quindi monitorati seguendo i cambi nel profilo dei siti di taglio preferenziali, portando all’identificazione delle regioni coinvolte nelle variazioni conformazionali. Sebbene quindi questo approccio fornisca dati a bassa risoluzione, è adatto proprio all’analisi di specie transienti o di intermedi parzialmente strutturati. Tale strategia inoltre può essere particolarmente efficace nello studio di complessi proteina-proteina. Infatti la principale caratteristica strutturale dell’interazione proteina-ligando consiste nel fatto che le regioni coinvolte sono accessibili al solvente nelle molecole isolate, ma risultano protette a seguito della formazione del complesso. Se si effettuano esperimenti di proteolisi limitata sia sulla proteina isolata che sul complesso si ottengono distinte mappe peptidiche dalle quali si può estrapolare la definizione delle zone all’interfaccia.

In questo programma di ricerca noi analizzeremo in maniera sistematica i mutanti della beta2-m che verranno prodotti nell’Unità di Ricerca di Pavia mediante esperimenti di scambio H/D con analisi per spettrometria di massa, fornendo così informazioni sugli effetti determinati dalle singole sostituzioni sulla flessibilità globale della proteina. La digestione con pepsina dei mutanti marcati con deuterio seguita da analisi con spettrometria di massa fornirà dettagli sulle regioni della proteina che sono esposte al solvente, o coinvolte in cambi conformazionali, o sufficientemente flessibili da essere quindi accessibili per interazioni proteina-proteina, e quindi possibilmente centri di nucleazione per la polimerizzazione. Queste analisi forniranno un profilo “locale” della flessibilità delle molecole proteiche.
Questo approccio sistematico sarà quindi accompagnato da esperimenti di proteolisi limitata su mutanti giudicati “interessanti” in modo da fornire ulteriori dettagli sui cambi conformazionali determinati dalle mutazioni.
Inoltre un approccio simile verrà utilizzato per analizzare l’interazione tra beta2-m (e/o suoi mutanti) ed il collageno.
I risultati ottenuti nella nostra Unità di Ricerca saranno complementari agli studi strutturali condotti per NMR sui medesimi mutanti presso l’Unità di Ricerca di Udine, con la quale ci sarà un confronto continuo, e fornirà dettagli che potranno essere utili anche per la comprensione molecolare delle analisi di stabilità dei mutanti che verranno condotte nell’Unità di Ricerca di Firenze.