RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Individuazione di determinanti di folding e misfolding mediante mutagenesi sistematica

Università di riferimento

Università degli Studi di GENOVA - FISICA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Annalisa Relini

Descrizione

L’attivita’ di ricerca dell’Unita’ di Genova consistera’ nello studio dell’aggregazione di mutanti della beta2-microglobulina (beta2-m) mediante microscopia a forza atomica (AFM). I mutanti di beta2-m saranno prodotti dall’Unita’ di Pavia e le nostre misure AFM saranno complementari ai risultati ottenuti a Pavia utilizzando la fluorescenza della tioflavina T, la marcatura con Congo red e la microscopia elettronica.
In particolare, i compiti dell’Unita’ di Genova sono i seguenti:
1 – caratterizzare la morfologia degli aggregati, sia in ambiente liquido sia in aria;
2 – effettuare un’analisi cinetica del processo di crescita delle fibrille;
3 – ottenere informazioni sull’influenza della carica superficiale e dell’idrofobicita’sul processo di aggregazione.
Questi compiti saranno sviluppati come segue:
1. Caratterizzazione strutturale di aggregati prefibrillari e fibrillari: questo compito si estendera’ per l’intera durata del progetto. Il processo di fibrillogenesi sara’ studiato nelle diverse condizioni di aggregazione utilizzate dall’Unita’ di Pavia:
i) incubazione a 37°C in sodio acetato 50 mM, pH 6.4 in presenza di collagene;
ii) incubazione a 37°C in sodio fosfato 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7.4, in presenza di trifluoroetanolo 20% e nuclei preformati (seeds);
iii) incubazione a 37°C in sodio citrato 50 mM, NaCl 100 mM, pH 2.5 in presenza di nuclei preformati.
Un’attenzione particolare verra’ rivolta alla condizione i) che e’ la piu’ vicina allo stato fisio-patologico mai riportata in letteratura; ci si aspetta pertanto che da essa possa scaturire un contributo significativo alla comprensione del processo di deposizione della beta2-m che avviene nell’amiloidosi associata ad emodialisi. L’aggregazione dei mutanti di beta2-m verra’ dapprima studiata in presenza di collagene fibrillare di tipo I utilizzando le stesse procedure messe a punto recentemente per la beta2-m wild type (Relini et al., 2006). Quindi le condizioni sperimentali saranno estese all’impiego di collagene di tipo II e di collagene umano, allo scopo di avvicinarsi ulteriormente alle condizioni fisio-patologiche. Tutti i tipi di collagene saranno preparati dall’Unita’ di Pavia. In questo contesto sara’ inoltre studiato l’effetto dell’eparina sul processo di fibrillogenesi. L’eparina infatti è impiegata come anticoagulante nell’emodialisi; misure AFM preliminari hanno mostrato che in presenza di concentrazioni di eparina paragonabili a quelle utilizzate nelle terapie, il processo di fibrillogenesi della beta2-m wild type e’ piu’ veloce.
Per le misure AFM, aliquote del campione saranno estratte a tempi diversi durante il processo di aggregazione e verranno depositate su una superficie di mica sfogliata di fresco. Si operera’ in modalita’ tapping, che permette di visualizzare campioni soffici senza danneggiarli, in aria o in soluzione acquosa. La procedura di deposizione del campione verra’ ottimizzata in base alla condizione di aggregazione utilizzata. Recentemente abbiamo osservato (Relini et al., 2006) che in presenza di collagene la fibrillogenesi e’ strettamente localizzata in prossimita’ della superficie del collagene; pertanto in questo caso si avra’ cura di depositare il collagene insieme alla goccia di soluzione che lo circonda. Impiegando le condizioni ii) e iii), i campioni da visualizzare in aria saranno drasticamente diluiti prima della deposizione allo scopo di evitare la cristallizzazione dei sali durante il processo di asciugatura. Le dimensioni degli aggregati saranno misurate attraverso il sezionamento delle immagini “in altezza” che essendo costruite mediante il segnale del piezoelettrico contengono informazioni quantitative. Inoltre verra’ misurata la lunghezza di persistenza delle fibrille.
2. Analisi cinetica del processo di crescita delle fibrille: verra’ misurata la lunghezza di un insieme statisticamente significativo di fibrille in funzione del tempo di aggregazione. Questi esperimenti ci permetteranno di determinare la velocita’ di elongazione delle fibrille e fornira’ informazioni sulla cinetica del processo di aggregazione. I risultati saranno confrontati con quelli ottenuti a Pavia utilizzando altre tecniche come la fluorescenza della tioflavina e la microscopia elettronica. Le condizioni di aggregazione e la preparazione dei campioni saranno le stesse descritte al punto 1. Questo compito si estendera’ per l’intera durata del progetto.
3. Effetto della carica superficiale e dell’idrofobicita’ sul processo di aggregazione: i risultati ottenuti finora indicano che le interazioni elettrostatiche hanno un ruolo importante nell’aggregazione della beta2-m; in particolare, per ottenere la formazione di fibrille a 37°C e pH 6.4 e’ richiesta le presenza di superfici cariche positivamente (come quelle presenti sulle fibre di collagene). Misure di potenziale zeta permetteranno di valutare la carica superficiale degli aggregati a tempi diversi del processo di aggregazione per mutanti diversi di beta2-m.
Un altro parametro degno di interesse e’ l’idrofobicita’ degli aggregati. Informazioni rilevanti possono essere ottenute confrontando la capacita’ di mutanti diversi di interagire con membrane modello come liposomi, membrane planari e monostrati di fosfolipidi. A seconda del sistema modello considerato, in questi esperimenti saranno effettuate, rispettivamente, misure di fluorescenza del rilascio di calceina incapsulata nei liposomi, analisi della morfologia delle membrane mediante AFM e misure della pressione superficiale dei monostrati. Questo compito sara’ effettuato nel secondo anno di progetto e coinvolgera’ un insieme rappresentativo di mutanti, selezionati in base ai risultati ottenuti nel primo anno dalle unita’ di ricerca coinvolte in questo progetto.

A. Relini, C. Canale, S. De Stefano, R. Rolandi, S. Giorgetti, M. Stoppini, A. Rossi, F. Fogolari, A. Corazza, G. Esposito, A. Gliozzi, V. Bellotti. (2006) Collagen plays an active role in the aggregation of beta2-microglobulin under physio-pathological conditions of dialysis-related amyloidosis. J. Biol. Chem., in press; doi 10.1074/jbc.M513827200.