RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Individuazione di determinanti di folding e misfolding mediante mutagenesi sistematica

Università di riferimento

Università degli Studi di PAVIA - BIOCHIMICA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Monica Stoppini

Descrizione

I compiti di questa unità operativa sono sostanzialmente quattro:
1) preparazione di mutanti di beta2-microglobulina, 2) caratterizzazione dei parametri di legame al collagene, 3) caratterizzazione dei parametri cinetici di formazione delle fibrille amiloidi utilizzando tre diversi test di fibrillogenesi, 4) ottimizzazione della procedura di formazione di fibre amiloidi di beta2-microglobulina in condizioni che mimano il microambiente biologico.

1) Preparazione di mutanti di beta2-microglobulina.
Questa attività sara condotta in stretta collaborazione con le unità di Firenze e Udine che parteciperanno alla progettazione del disegno sperimentale. Prevediamo di realizzare due categorie di mutanti: quelli ottenuti da mutagenesi sistematica in cui viene modificato un residuo ogni tre presenti nella sequenza con la sostituzione di un qualunque aminoacido con un’alanina e una serie di mutanti scelti sulla base di dati strutturali che attribuiscono a questi residui un importante ruolo nel folding normale e patologico. Per questo secondo tipo di approccio vengono considerati siti interessanti di mutazione tre categorie di residui:
A) aminoacidi situati in zone di maggiore esposizione superficiale nella molecola completamente foldata;
B) aminoacidi situati in zone a maggiore esposizione superficiale, in assenza degli strand I e VIII, probabilmente coinvolti nel partial unfolding della beta2-microglobulina;
C) residui situati nel core della proteina che in base a spettri NMR 1D ottenuti dalla UO di Udine cambiano configurazione durante la fase lenta del refolding (come ad esempio L23, I35, V37, L40).
Seguendo questi criteri avremo una distribuzione abbastanza omogenea di siti da mutare nella proteina anche se non perfettamente regolare come quello ottenuto dalla sistematica mutazione ogni tre residui. Tutti i residui carichi e polari verranno sostituiti con alanine, mentre i residui idrofobici verranno sostituiti con serine. Effettivamente il maggior numero di mutazioni (18 su 30) coinvolge residui carichi
Dieci residui mutati sono coinvolti nelle interazioni con la catena pesante dell’MHCI.
Nelle zone in cui non si configura una regolare sostituzione 1/3 si prevede di operare con mutagenesi sistematica. La combinazione dei due approcci ci porta a dover predisporre 40 mutanti della proteina di cui 12 già disponibili, perfettamente espressi in buone quantità e già utilizzabili.
La beta2-microglobulina wild type e sue isoforme verranno espresse come precedentemente descritto (13,21) utilizzando il vettore plasmidico pHN1 in cui è inserito il cDNA della beta2-microglobulina sotto il controllo del promotore Lac. La mutagenesi sito specifica verrà condotta con il sistema QuikChange della ditta Stratagene che permette di introdurre mutazioni partendo dal cDNA inserito in plasmidi a doppio filamento. La procedura prevede la denaturazione del plasmide e la riassociazione di due oligonucleotidi sintetici che contengano la mutazione desiderata. In base al progetto predisposto sarà necessario prepare una serie di primer contenenti uno o due nucleotidi mismatch. Una DNA polimerasi Pfu Turbo estende ed incorpora i primers mutagenizzati così da creare un filamento circolare contenente la mutazione. La endonucleasi DpnI viene poi utilizzata per digerire lo stampo di DNA non mutato e si è rivelata estremamente efficace nel vettore che stiamo utilizzando. Tutte le isoforme verranno espresse sotto forma di corpi inclusi e sottoposte a rinaturazione come precedentemente pubblicato (21). Tutti i mutanti verranno purificati e controllati con spettrometria di massa. I mutanti di beta2-microglobulina prodotti verranno distribuiti alle altre 4 unità operative coinvolte nelle seguenti attività :
I ) studio della struttura tridimensionale in soluzione e formazione di complessi beta2-microglobiulina/catena pesante di MHCI (UO Udine),
II) caratterizzazione della formazione di fibrille su fibre collageniche (UO Genova),
III) determinazione dell’accessibilità al solvente e flessibilità strutturale mediante spettrometria di massa associata a scambio idrogeno/deuterio e proteolisi limitata (UO Napoli),
IV) caratterizzazione della stabilità termodinamica e delle cinetiche di folding/unfolding (UO Firenze).

2) Determinazione dei parametri di legame dei mutanti a varie isoforme di collagene.
Per ogni mutante prodotto verranno determinati i paramentri di legame al collagene tipo I e tipo II sia di origine bovina che di origine umana. A questo scopo si utilizzerà il sistema BIACORE già utilizzato per un numero limitato di mutanti della proteina (10) usando microchips su cui abbiamo già immobilizzato campioni di tripla elica collagenica, mentre per il collagene tipo II e il collagene umano dovranno essere predisposte nuove matrici immobilizzate. Per ogni mutante sarà così possibile determinare aspetti dinamici della interazione quali Kon e Koff così come la costante di dissociazione all'equilibrio (Kd). Sarà valutato l'effetto dei due diversi pH (pH 6.4 e pH 7.4) su cui ci siamo concentrati perchè rappresentativi delle condizioni fisio-patologiche. La dinamica di interazione beta2-microglobulina/collagene potrà essere valutata in presenza di concentrazioni di eparina simili a quelle utilizzate in uno dei metodi di fibrillogenesi, nell'ipotesi che l'eparina possa modificare l'energia di legame tra le due proteine.

3) Fibrillogenesi.
Questa unità operativa si occuperà della esecuzione di tre metodi di fibrillogenesi che presuppongono gradi diversi di cambiamenti conformazionali necessari alla formazione di fibre amiloidi:
A) ampia denaturazione della proteina a pH acido,
B) ampio mantenimento della struttura ed esaltazione dei ponti idrogeno in presenza di 20% di trifluoroetanolo,
C) conservazione completa della struttura nativa in ambiente arricchito di fattori biologici (collagene-eparina) caratterizzanti il tessuto bersaglio di questa particolare amiloidosi.

A) Il primo metodo prevede l’incubazione della beta2-microglobulina a pH acido (in tampone NaCitrato 50mM, NaCl 100mM, pH 2.5) a 37°C in presenza di nuclei di fibrille preformate, secondo la procedura riportata da Naiki et al. (22).
B) Nel secondo metodo la proteina viene incubata a 37°C in tampone NaFosfato 50mM, NaCl 100 mM, pH 7.4, in presenza di trifluoroetanolo al 20% e di nuclei fibrillari preformati. Il processo di aggregazione sarà monitorato mediante il saggio spettrofluorimetrico con tioflavina T e confermato in microscopia ottica (colorazione con rosso congo) e microscopia elettronica.
C) Il terzo metodo prevede l’uso di agenti biologici favorenti la fibrillogenesi e verrà condotto in parallelo tra la nostra unità operativa e l’unità operativa di Genova. Verrà sviluppata la nostra recente osservazione riguardante il ruolo delle fibre collageniche nella formazione di fibre amiloidi sulla superficie della fibra collagenica (20). Gli esperimenti di aggregazione verranno condotti incubando la beta 2-microglobulina con collagene fibrillare di tipo I e tipo II in tampone ammonio acetato 50 mM, pH 6.4 a 37°C e i campioni saranno analizzati attraverso microscopia a forza atomica per monitorare la formazione di fibrille.
La procedura di preparazione delle fibre collageniche di tipo I verrà condotta come descritto in precedenza (10, 20) mentre la preparazione del collagene di tipo II richiederà una fase di pre-estrazione dei proteoglicani che verrà condotta in presenza di GdnHCl 4M e successiva tripsinizzazione delle fibre insolubili.

4) Ottimizzazione della procedura di formazione di fibre amiloidi di beta2-microglobulina in condizioni che mimano il microambiente biologico.
Questa UO sarà particolarmente impegnata anche nello sviluppo di nuovi aspetti del terzo metodo di fibrillogenesi sopra descritto in cui si è utilizzato fino ad ora collagene fibrillare di tipo I di origine bovina. Abbiamo programmato di sviluppare un test che utilizzi collagene di tipo II che è altamente rappresentato nella cartilagine e soprattutto prevediamo di introdurre collagene umano. Questo collagene verrà purificato da campioni di cute di soggetti normali sottoposti a procedure chirurgiche in cui porzioni di cute vengono rimossi e non sono utilizzati per nessun altro scopo di interesse clinico (questa parte di lavoro verrà realizzata con il consenso dei locali comitati di bio-etica).
Verrà inoltre valutato il ruolo che l’eparina può svolgere in questo sistema di fibrillogenesi, che al momento può essere considerato quello più vicino alle condizioni fisio-patologiche. Dati preliminari già ottenuti dalle unità operative di Pavia e Genova sono molto incoraggianti, poichè indicano che l’eparina accelera in modo molto sensibile la formazione di fibre amiloidi sulla superficie della fibra collagenica a concentrazioni variabili da 1 a 10 ug/ml; concentrazioni che corrispondono a quelle che si realizzano nel sangue durante la procedura emodialitica in cui l’eparina viene utilizzata come anticoagulante.