RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Individuazione di determinanti di folding e misfolding mediante mutagenesi sistematica

Università di riferimento

Università degli Studi di UDINE - SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMEDICHE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Gennaro Esposito

Descrizione

I gruppi proponenti sono stati impegnati, negli ultimi anni, in ampi ed intensi studi su b2m, con approcci di biochimica e biologia molecolare affiancati da una serie di approcci biofisici quali proteolisi limitata controllata mediante spettrometria di massa, NMR e AFM, che risultano particolarmente appropriati per lo specifico problema biologico. Il nostro gruppo ha, in particolare, eseguito la parte di indagine di spettroscopia NMR e modelling. I risultati dell’indagine strutturale su b2m e sul frammento privo dell’esapeptide N-terminale (DN6b2m) sono stati esposti in precedenza.
Il quadro delineato in base alle conclusioni strutturali NMR suggerisce che DN6b2m potrebbe essere considerata una conformazione amiloidogena (Esposito et al., 2000; Verdone et al., 2002; Esposito et al., 2005). I dati di proteolisi di fibrille mostrano che il pattern di proteolisi di fibrille è identico, sia per fibrille della b2m intera, sia per fibrille del frammento DN6b2m, e che quest’ultimo frammento viene prodotto da fibrille della molecola intera (Monti et al., 2002). Le fibrille dovrebbero formarsi dalla proteina intera, una volta che la conformazione nativa venga destabilizzata a favore di, o sequestrata dalla competizione con, una conformazione amiloidogena simile a quella descritta per il frammento DN6b2m.

Precedente progettazione di mutanti
La logica che ci ha portato a riconoscere i prodromi della transizione amiloide di b2m è stata già messa in atto per progettare mutanti e varianti della molecola. In particolare, il ruolo cruciale per la stabilità di H31 ci ha suggerito di produrre un mutante che, pur mantenendo il carattere aromatico della catena laterale, non potesse essere caricato a pH intorno alla neutralità. In accordo con le aspettative, il mutante H31Y, in cui una tirosina sostituisce l' istidina, è più stabile della sequenza naturale di 1.5 kcal/mol, mentre la perdita della catena aromatica ottenuta mediante mutazione con serina stabilizza la molecola di sole 0.6 kcal/mol (Corazza et al., 2004). La struttura del mutante H31Y, determinata simultaneamente mediante raggi X ed NMR (Rosano et al., 2004) mostra i) la prossimità conformazionale di H31Yb2m con la sequenza naturale quando questa è nel complesso di MHC-1 (Bjorkman et al., 1987) o isolata in soluzione (Verdone et al, 2002), ma non quando la specie isolata è nella forma cristallina (Trinh et al, 2002), e ii) la eterogeneità conformazionale nel cristallo di H31Yb2m che comprende un conformazione alternativa minoritaria in cui il segmento N-terminale (strand A) è spostato dalla sua posizione nativa, in accordo con la evoluzione proposta verso la conformazione amiloidogena. Oltre a predire mutanti più stabili basati sul residuo critico H31, le informazioni strutturali sulla struttura in soluzione potevano essere usate per ipotizzare mutanti meno stabili della sequenza naturale. Per esempio, abolendo la carica e la lunga catena laterale di R3, si sarebbe dovuto ottenere un mutante meno stabile, come in effetti fu verificato sostituendo R3 con alanina. Il mutante R3A è destabilizzato di 0.4 kcal/mol rispetto alla sequenza naturale, ma la sua struttura NMR appare ancora molto simile a quella della sequenza parentale, con limitato aumento di dispersione conformazionale in corrispondenza dei loop DE e FG (Corazza et al., 2004). Mentre la soppressione della carica positiva in posizione 31 nel mutante H31Y influenza principalmente il contributo elettrostatico alla energia libera di folding, la soppressione della carica positiva in posizione 3 per il mutante R3A influenza soprattutto il corrispondente contributo di solvatazione (Corazza et al., 2004). I contributo di energia libera di solvatazione dovrebbe costituire gran parte della diminuzione totale di energia libera pari a 1.9 kcal/mol per DN3b2m, la variante troncata di b2m priva del tripeptide N-terminale, sebbene in questo caso la effettiva mancanza di un frammento di sequenza impedisce il paragone diretto con la specie intera. Inoltre la presenza in DN3b2m di un residuo N-terminale metionilico derivante da espressione in E. coli, pone un gruppo ammonio N-terminale in posizione 3 e perciò non sopprime totalmente la carica positiva in questa posizione. Ciò potrebbe rendere conto della conservazione sostanziale del folding terziario in DN3b2m dedotto dalla relativa invarianza dei chemical shift NMR rispetto a quelli della proteina intera, in contrasto con la specie troncata DN6b2m estesamente destrutturata (Esposito et al., 2000) che risulta anche la variante di b2m più destabilizzata (2.5 kcal/mol).
Per b2m e varianti, la ricerca di intermedi portò alla identificazione di una forma in conversione lenta lungo la via del refolding, indicata come I2 (Chiti et al 2001; Corazza et al., 2004). La labilità cinetica di I2 mostrò una correlazione opposta alla stabilità termodinamica dela conformazione finale totalmente strutturata. In base ai dati NMR, la popolazione di equilibrio di I2 risultava in generale piuttosto ridotta, fatta eccezione per la sequenza troncata DN3b2m. In questo caso, I2 rappresentava circa il 25% della concentrazione proteica totale a 298 K.

Schema della strategia generale
In base ai precedenti risultati, appare chiare che una ricerca fondamentale multidisciplinare è necessaria per valutare i determinanti strutturali del folding anomalo che conduce all’amiloide in b2m. In aggiunta agli strumenti di base di indagine strutturale e funzionale, le proteine amiloidogene possono essere studiate mediante metodi di fibrillogenesi rapida a pH neutro che non obbligano ad usare condizioni estreme come bassi pH, conentrazioni elevate di ioni metallici, ecc. É possibile ottenere fibrille di b2m sfruttando la modulazione idrofobica o l’ordinamento elettrostatico a corto raggio (Yamamoto et al., 2004a; 2004 b; Myers et al., 2006; Relini et al., 2006). Un esame della propensità a formare fibrille di un ampio spettro di mutanti di b2m, progettati sistematicamente per mappare l’intera sequenza, viene qui proposto per analizzare, a livello di contributo di singolo residuo, la propensità amiloidogena. I gruppi proponenti posseggono una consolidata esperienza e gli opportuni protocolli metodologico-sperimentali per studiare i diversi aspetti della biochimica e biofisica di b2m. L’espressione e purificazione dei prodotti sarà effettuata dall’unità di Pavia. La stessa unità determinerà la stabilità termodinamica dei prodotti mediante misure spettroscopiche di denaturazione chimica, e la velocità di fibrillogenesi mediante due diversi protocolli, cioè i) seeding a pH acido, e ii) seeding in presenza di trifluoroetanolo. La accessibilità del solvente e la flessibilità strutturale saranno studiate mediante proteolisi limitata dall’unità di Napoli. La fibrillogenesi eterogenea su fibre di collagene sarà studiata mediante AFM, insieme con la caratterizzazione morfologica dei depositi dall’unità di Genova. Le cinetiche di folding, unfolding e refolding saranno studiate mediante stopped-flow dall’unità di Firenze. La caratterizzazione strutturale e dinamica mediante NMR dei vari prodotti ed i calcoli di modelling relativi verranno effettuati presso l’unità di Udine (il dettaglio di impegno specifico verrà illustrato nel seguito). Infine, l’unità di Firenze raccoglierà tutti i risultati e parametri sperimentali dall’intera compagine del progetto per formulare un algoritmo parametrico generale che possa fornire predizioni e valutazioni per i processi di misfolding e fibrillogenesi di b2m

Criteri di progettazione di mutanti
Per approntare una lista operativa per un piano di mutazioni di b2m diverso dalla sostituzione generalizzata sistematica di residui di Ala in tutte le posizioni della molecola, alcuni criteri sono stati stabiliti per restringere i siti di mutazione. I criteri sono:
i) le mutazioni dovrebbero riguardare quei residui con la massima esposizione superficiale nella conformazione nativa;
ii) le mutazioni dovrebbero riguardare quei residui con massima espeosizione superficiale in assenza degli strand A (I) e G (VIII), cioè i due segmenti molto verosimilmente coinvolti nella destrutturazione parziale di b2m;
iii) le muatzioni dovrebbero interessare quei residui che, in base dati 1D NMR degli esperimenti di refolding, risultano evolvere durante il refolding lento (L23, I35, V37, L40).
Seguendo questi criteri, si ottiene una distribuzione di siti di mutazione abbastanza omogenea lungo tutta la sequenza di b2m, sebbene non proprio così regolare di quella ottenibile mutando sistematicamente un residuo ogni tre posizioni. La maggior parte delle mutazioni (18 su 30) interessa residui carichi. Alcune mutazioni consecutive sono state mantenute, per esempio K58 e D59 perché questi residui appartengono al loop critico D-E e dovrebbero stabilire una importante interazione con il prospiciente loop B-C. Circa dieci tra i residui selezionati per le mutazioni sono coinvolti in interazioni con la catena pesante di MHC-I. Complessivamente sono state selezionate 30 mutazioni (in aggiunta ai mutanti in posizione 3 e 31, già considerati), secondo lo schema seguente:





Compiti sperimentali specifici
L'unità di Udine sarà innanzitutto impegnata nella cartterizzazione NMR dei differenti mutanti espressi di b2m. Una determinazione conformazionale dettagliata non sarà possibile per tutti i prodotti. La selezione dei mutanti che meriteranno attenta considerazione per la caratterizzazione strutturale verrà effettuata sulla base delle informazioni fornite dalle altre unità.
Le tecniche NMR che saranno impiegate per questi studi sono quelle standard per la spettroscopia protonica ed eteronucleare 2D e 3D, supportate da modeling molecolare condizionato. In particolare, sono previste acquisizioni di spettri 2D 1H TOCSY, NOESY e COSY con filtri doppio e triplo-quantitici, di spettri di correlazione 1H-15N via SQC e MQC con e senza step di trasferimento successivo TOCSY e NOESY in 2 e 3 dimensioni. Alcuni di questi esperimenti richiedono l’uso di campioni marcati in 15N che saranno acquistati da ASLA (Riga, Lettonia), una volta che un soddisfacente protocollo di espessione sia disponibile.
Comparazioni strutturali a grandi linee tra differenti mutanti possono essere ottenute da analisi di pattern di attenuazione paramagnetica misurati in presenza ed assenza di spin label (Esposito et al., 1992) o addirittura da pattern di accessibilità differenziale del solvente (Dalvit, 1996, 1998).
Oltre alla caratterizzazione strutturale di base, la spettroscopia NMR può essere usata per misurare i parametri di mobilità molecolare mediante studi di rilassamento di 15N. Misure di rilassamento comparative possono fornire informazioni veloci sui profili di mobilità segmentale di differenti mutanti.
La spettroscipia NMR può anche fornire informazioni dettagliate di stabilità di struttura secondaria mediante misure di velocità di scambio isotopico, Queste velocità possono essere determinate sia in condizioni distanti rispetto a quelle denaturanti, dove prodomina il regime di scambio non correlato (EX2) e che consentono di ottenere parametri termodinamici di stabilità locale, sia in prossimità di denaturazione, quando viene osservato lo scambio correlato per valutare la cinetica del processo di denaturazione (EX1). Determinazioni di spettrometria di massa con ionizzazione elettrospray saranno complementari alle determinazioni NMR e saranno di aiuto specie per indagare processi veloci.
Una parte importante dell’analisi NMR verrà dedicata alle cosiddette determinazioni real-time NMR, mediante le quali siamo stati in grado di seguire l’evolizione cinetica degli intermedi di refolding lenti di parecchie varianti di b2m, per trarre conclusioni strutturali sulla loro natura. Questo tipo di determinazioni è condotto mediante NMR con una osservazione continua di una soluzione di proteina denaturata in GdnCl che viene rapidamente diluita con un tampone di refolding. Contiamo di effettuare questo tipo di determinazioni con tutti i mutanti che verranno avviati all’indagine NMR. In circostanze favorevoli, un mutante potrebbe anche mostrare intermedi lenti di unfolding che possono essere egualmente studiati mediante NMR 1D e paragonati con i pattern ottenuti da corrispondenti esperimenti di refolding. Lo stesso tipo di determinazioni può essere eseguito in presenza della catena pesante di MHC-I, in particolare quando la mutazione che viene esaminata riguarda un residuo di cui sia noto il contatto con la catena pesante. La semplice presenza di catena pesante nel tampone di refolding potrebbe alterare la velocità del processo se la conformazione destrutturata possiede una qualche affinità per la catena pesante. L'entità della interazione tra catena leggera e pesante può essere analizzata mediante classici esperimenti di transfer NOE (Clore and Gronenborn, 1982) effettuati in condizioni stazionarie.
Tutti i risultati ottenuti dagli studi strutturali e dinamici NMR saranno resi dispobibili a tutte le altre unità, ed in particolare alla unità di Firenze che raccoglierà tutte le evidenze sperimentali dello studio sistematico proposto dal presente progetto di ricerca per individuare correlazioni generali per determinanti di misfolding ed amiloidogenesi di b2m.