RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi di controllo dell’eritropoiesi e policitemie congenite e familiari: ruolo delle vie di risposta alla pressione di ossigeno

Università di riferimento

Seconda Università degli Studi di NAPOLI - BIOCHIMICA E BIOFISICA "FRANCESCO CEDRANGOLO" - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Fulvio Della Ragione

Descrizione

I processi biochimici descritti nell’Introduzione, che coinvolgono le proteine VHL e HIF1-alfa e PHD rappresentano i meccanismi molecolari attraverso i quali i mammiferi rispondono alle variazioni della pressione dell’ossigeno ematico. Queste vie, che non sono esclusivamente modulate dall’ipossia, controllano importanti eventi sia metabolici (quali il metabolismo del glucosio) sia fenotipici, quali angiogenesi, ciclo cellulare, differenziamento ed apoptosi.
Recentemente, nel corso di un ampio studio, abbiamo evidenziato che alcune alterazioni di VHL determinano una parziale inattivazione della degradazione di HIF1-alfa. L’incremento del fattore di trascrizione, a sua volta, causa una aumentata espressione dei suoi geni bersaglio (tra cui l’Epo ed il VEGF), che inducono infine una stimolazione dell’eritropoiesi ed aumento del numero di eritrociti (policitemia). Questa forma di policitemia congenita VHL-dipendente è stata ossservata inizialmente in una regione della Russia (Chuvashia). Nel nostro studio abbiamo dimostrato che essa è anche significativamente frequente nell’Italia meridionale (in particolare, ad Ischia una isola del golfo di Napoli, ref. 46).
Scopo generale del progetto presentato da questa unità è studiare i meccanismi biochimici e molecolari coinvolti nella risposta a variazione di pressione di O2 e, in modo particolare, le alterazioni di tali vie nella policitemia ereditaria. I risultati
ottenuti avranno un significato non solo relativo specificamente alla patologia eritrocitaria investigata ma anche uno più ampio, correlato all’acquisizione di nuove informazione sui processi controllati dall’O2.

Il progetto proposto ha i seguenti obiettivi:
1) Sviluppo di approcci biochimici per studiare i meccanismi di risposta a variazioni della pressione di O2.

2) Analisi delle vie responsive all’ipossia nelle cellule BFU-E e CFU-E da soggetti normali e pazienti affetti da policitemia dovute ad alterazione della vie O2-dipendenti.

3) Caratterizzazione dei meccanismi mediante i quali i soggetti con mutazioni di VHL in eterozigosità mostrano un fenotipo policitemico.
Un aspetto critico della policitemia da mutazioni di VHL è la presenza di alcuni eterozigoti affetti dalla malattia mentre in genere, essendo la patologia recessiva, gli eterozigoti non mostrano alcuna alterazione dell’ematocrito. Nei modelli cellulari preparati da questi soggetti, studieremo l’attività delle maggiori tappe delle vie dipendenti dall’ossigeno.

4) Identificazione dei meccanismi attraverso i quali i progenitori eritroidi da soggetti con policitemia congenita rispondono maggiormente ai livelli normali di Epo.
Una interessante caratteristica delle policitemie ereditarie è la forte risposta proliferativi dei precursori eritroidi (cellule BFU-E e CFU-E) dei pazienti all’Epo. Tale evento è importante poiché esso può spiegare la mancanza di un rapporto diretto tra concentrazione di Epo e gravità dell’eritrocitosi. Pertanto, intendiamo valutare la presenza di meccanismi endogeni aggiuntivi, inclusa la produzione di citochine e l’attivazione costitutiva di specifiche vie di trasduzione, che possono giocare un ruolo importante nell’origine della malattia.

Piano sperimentale dettagliato
Il piano sperimentale è organizzato in base agli obiettivi sopra riportati.
1) Sviluppo di approcci biochimici per studiare i meccanismi di risposta a variazioni della pressione di O2.
Risultati precedenti ds noi ottenuti (46) hanno dimostrato che linee linfoblastoidi derivate da linfociti B di pazienti affetti da policitemia dovuta ad alterazioni di VHL presentano un aumento dell’espressione di VEGF. Al contrario, la trascrizione di altri geni bersaglio di HIF1-alfa, cioè Epo, SDF-1, trioso-fosfato isomerasi, aldolasi e GAPDH non appare essere modificata (46). Da notare che questo dato era confermato dallo studio dei ìreticolociti (46). Pertanto, uno degli approcci più usati, cioè l’analisi dell’espressione di geni target di HIF1-alfa, si dimostrava chiaramente insufficiente per identificare alterazioni di vie molecolari O2-dipendenti.
Pertanto, uno dei nostri obiettivi primari sarà stabilire parametri biochimici ottimali per evidenziare modificazioni di vie modulate dall’ossigeno.

In relazione alla notevole complessità dei pathways investigati, il problema verrà affrontato a due differenti livelli, cioè valutazione: 1) dell’attività di HIF1-alfa??e 2/ dell'espressione di un pattern fenotipo-dipendente di geni bersaglio del fattore di trascrizione.
La dipendenza dal fenotipo rappresenta un punto critico nell’individuazione dell’array di geni da impiegare come markers.

L’attività di HIF1-alfa rappresenta il punto funzionale su cui convergono le vie che rispondono all’ipossia ematico. Pertanto, sarà importante standardizzare metodologie per valutare questo parametro. Alcune di queste metodologie sono state preliminarmente sviluppate nel laboratorio del proponente, ed in particolare un sensibile saggio per immunoblotting per stabilire il contenuto della proteina ed un saggio ELISA per valutarne l'attività (46). Inoltre, sarà sviluppato un saggio EMSA per studiare l'attività di HIF1-alfa nel contesto fisiologico degli altri cofattori nucleari che partecipano alla formazione del suo complesso attivo (CBP, p300, istone acetilasi e deacetilasi).
Un ulteriore meccanismo di regolazione dell'attività di HIF1-alfa appare essere la sua localizzazione. Infatti, poiché la proteina funziona formando complessi a livello nucleare, la sua localizzazione appare essere estremamente importante. Infatti, un possibile meccanismo di controllo della sua attività, è la sua rilocalizzazione e compartimentalizzazione cellulare. Noi abbiamo sviluppato consolidate metodologie biochimiche per ottenere preparazioni subcellulari estremamente ben caratterizzate (47). Inoltre, l'uso di tecniche di immunoistochimica e di microscopia confocale permetterà ulteriormente di valutare la localizzazione di HIF1-alfa.
In conclusione, lo sviluppo di molteplici metodologie per la valutazione dei livelli e della funzione di HIF1-alfa rappresenta il modo ottimale per valutare lo status delle vie che rispondono alla pressione di O2.

L'identificazione di un pannello di proteine (e di geni), la cui espressione sia diagnostica per evidenziare la modulazione di vie dipendenti dall'ossigeno ed importanti nello sviluppo di patologie, rappresenta un secondo obiettivo di questa parte del progetto. Infatti, appare possibile che piccole variazioni dell'attività di HIF1-alfa non siano evidenziabili mediante le metodologie descritte mentre lo sia dallo studio dell’espressione di un gruppo di geni. E’ estremente importante che la costruzione di tale pannello sia tessuto specifico, in modo da: 1) limitare il numero di geni da studiare; 2) aumentare il valore dei risultati ottenuti, e 3) dare un significato funzionale ai dati. In particolare, ovviamente, sarà importante caratterizzare i geni modulati dal pathway O2-dipendente nei precursori eritroidi. Per ottenere tali risultati, coltiveremo cellule con differente fenotipo (tra cui BFU-E ed CFU-E) con inibitori delle PHD, cioè cloruro di cobalto o desferossamina. Queste molecole, sebbene con meccanismi diversi (nel primo, il cobalto sostituisce il ferro dal sito attivo dell'enzima, nel la desferossamina chela il ferro), inibiscono gli enzimi che idrossilano HIF1-alfa incrementando i livelli del fattore di trascrizione? Successivamente, analizzeremo il trascrittoma di cellule trattate o non trattate mediante array commerciali di espressione o mediante nuove metodologie basate sull’impiego di real-time PCR. I risultati ottenuti daranno informazioni su pattern di espressione regolati dall’O2 in uno specifico fenotipo cellulare- Questo ci permetterà di costruire un array di geni (non più di 100) da investigare che sia cellula-specifico. Naturalmente, concentreremo la nostra attenzione particolarmente nel fenotipo eritroide. Successivamente, l'analisi di questi geni verrà condotta mediante una metodologia di real-time PCR recentemente sviluppate (basata su primers selettivi e librerie di un numero relativamente limitato di oligo fluorescenti) che permette l’analisi contemporanea dell'espressione di numerosi geni. L'uso di PCR quantitativa rappresenta un passo in avanti importante per lo studio dei pattern limitati di espressione in quanto permette di ottenere dati direttamente consolidati e non (come negli array di espressione) da verificare.


2) Analisi delle vie responsive all’ipossia nelle cellule BFU-E e CFU-E da soggetti normali e pazienti affetti da policitemia.

In questa parte del progetto, verrà studiata l’interazione tra alterazioni delle vie di risposta alla pressione di O2 e lo sviluppo della policitemia. Un aspetto centrale di questo studio è la selezione di adeguati modelli sperimentali. Infatti, in letteratura vengono impiegati in genere fenotipi cellulari non adatti che portano a conclusioni di scarso valore.
Noi abbiamo scelto di impiegare: 1) linfociti B (da controlli e pazienti con policitemia congenita) immortalizzati mediante il virus di Epstein-Barr e 2) cellule BFU-E a CFU-E (preparate da colture liquide di precursori eritroidi) da soggetti normali e con eritrocitosi. L’immortalizzazione mediante virus EBV e la coltura e purificazione delle cellule BFU-E e CFU-E verrà condotta dalle altre due unità del progetto. Nel caso di linee linfoblastodi stabilizzate, esse saranno coltivate nel laboratorio del proponente.
Gli studi verranno maggiormente dedicati all’analisi della funzionalità delle vie modulate dall’ossigeno e non alla descrizione di alterazioni genetiche.
Pertanto, analizzeremo maggiormente l’attività HIF1-alfa mediante i metodi descritti al punto 1. Nei casi in cui non dimostreremo alterazioni, investigheremo l’espressione dei geni target del fattore di trascrizione. Questi studi saranno condotti mediante real time PCR (vedi punto 1) ed immunoblotting.
Nel caso di alterazioni quantitative o qualitative di HIF1-alfa, una diversa unità del progetto (unità del Dr. Perrotta) analizzerà le sequenze di VHL, HIF1-alfa, culline, PHDs e altri geni coinvolti nelle vie metaboliche di risposta all’ossigeno.
Se nessuna alterazione verrà messa in evidenza, caratterizzeremo il processo di degradazione di HIF1-alfa .
Come approccio iniziale, aggiungeremo alle cellule, inibitori del proteasoma (LLnL e lattacistina) per indurre un aumento del contenuto di HIF1-alfa. In questi campioni, analizzeremo, la quantità di HIF-1? ubiquitinata impiegando una strategia che coinvolge l’immunoprecipitazione del fattore di trascrizione e l’analisi dell’immunoprecipitato mediante anticorpi diretti contro l’ubiquitina. Questi esperimenti dovrebbero fornire dati circa l’efficienza del processo di ubiquitinazione e, di conseguenza, circa l’attività di VHL-E3 ubiquitina ligasi.
Inoltre, studieremo l’ubiquitinazione in vivo di HIF1-alfa transfettando le cellule con vettori di espressione che codifichino per Ubiquitina-Myc. Dopo immunoprecipitazione di HIF1-alfa, l’immunoprecipitato sarà analizzato mediante anticorpi anti c-Myc. Inoltre, utilizzando HIF1-alfa ricombinante, valuteremo la velocità di degradazione del fattore di degradazione in vitro impiegando estratti preparati da precursori eritroidi ottenuti sia da celule controllo sia soggetti policitemici.
Gli approcci descritti (cioè l’uso di inibitori del proteasoma e la degradazione in vitro) sono stati con successo impiegati nel laboratorio del proponente per studiare la degradazione in vitro di p27Kip1, un importante inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti, che avviene, come nel caso di HIF1-alfa, attraverso il processo di ubiquitinazione e degradazione proteasomica (47, 48). Se nel corso di questi studi identificheremo specifiche alterazioni, caratterizzeremo mediante immunoblotting i componenti del complesso VHL-E3, e studieremo il meccanismo molecolare responsabile delle alterazioni.
Infine, prenderemo in esame le attività PHD e FIH attraverso i metodi riportati in letteratura.
I dati ottenuti chiarificheranno le alterazioni che possono causare la policitemia congenita da alterazioni delle vie O2-dipendenti. Tali conoscenze forniranno anche nuove informazioni su queste vie cellulari.


3) Caratterizzazione dei meccanismi mediante i quali i soggetti con mutazioni di VHL in eterozigosità mostrano un fenotipo policitemico.

Un aspetto interessante dell’interazione tra le vie O2-dipendenti e la policitemia è la presenza di pazienti affetti da mutazioni di VHL (tipo Chuvash) in eterozigosità che mostrano il fenotipo policitemico. Infatti, essendo la patologia recessiva, la maggioranza degli eterozigoti con questa mutazione sono completamente normali. Casi con questa condizione sono stati da noi individuati (46).

Impiegheremo come modello sperimentale, colture di cellule BFU-E e CFU-E e cellule linfoblastoidi, provenienti da soggetti eterozigoti normali e malati.
Inizialmente, valuteremo, mediante le metodologie descritte in precedenza, se sia evidenziabile nei soggetti eterozigoti policitemici un aumento dell’attività HIF1-alfa. Dati preliminari sembrano confermare tale ipotesi. Successivamente, studieremo l’ubiquitinazione di HIF1-alfa, la sua degradazione e localizzazione e l’attività di PHD e di FIH.
I dati ottenuti dovrebbero permetterci di identificare il difetto cellulare capace di mutare una condizione normale in una policitemia.
Se questi studi daranno risultati negativi, studieremo alcune delle vie dipendenti da VHL che non sono correlate alla risposta all’ossigeno. Infatti è stato dimostrato che mutazioni di VHL regolano i livelli e l’attività di proteine in aggiunta a HIF1-alfa. In particolare, la quantità delle cicline e delle chinasi ciclina-dipendenti (cdk), che regolano il ciclo cellulare, appaiono interessanti sotto questo punto di vista. Infatti, bassi livelli di attività VHL sono stati riportati incrementare i livelli di ciclina D1 e di cdk6, determinando un aumento della velocità di crescita. Infine, in assenza di queste alterazioni, ipotizzeremo la presenza di geni mutatori la cui presenza resterà da identificare mediante un approccio genetico (analisi dei polimorfismi per singola base, SNPs).


4) Identificazione dei meccanismi attraverso i quali i progenitori eritroidi da soggetti con policitemia congenita rispondono fortemente ai livelli normali di Epo.

Un aspetto importante e frequente della policitemia congenita è che i precursori eritroidi sviluppano colonie in numero maggiore e di dimensioni più grandi rispetto alla controparte normale. Inoltre, queste colonie rispondono significativamente meglio all’Epo rispetto alle colonie da soggetti controllo.
Numerose ipotesi possono spiegare queste osservazioni.
1) Alcuni esperimenti hanno correlato la regolazione del ciclo di divisione cellulare all’eritrocitosi. Pertanto, valuteremo i maggiori componenti del ciclo cellulare nelle cellule BFU-E e CFU-E, da pazienti e soggetti controllo, cresciuti in un mezzo liquido. Il nostro gruppo ha una esperienza consolidata negli studi sul ciclo cellulare, inclusi il livello e l’attività delle cicline, cdk e inibitori delle cdk, p53 ed pRb (47, 48).
2) E’ possibile che i progenitori eritroidi producano citochine che mediante un meccanismo autocrino o, alternativamente, un meccanismo intracellulare, stimolano o facilitano la crescita cellulare. Tale processo è possibile nel caso delle mutazioni di VHL in cui le BFU-E e le CFU-E possono produrre VEGF a/o Epo. E’ importante notare che recentemente è stato dimostrato che i precursori eritroidi sintetizzano VEGF che, agendo attraverso un meccanismo che richiede recettori intracellulari, sembra essere necessario per la proliferazione di queste cellule.
3) Infine, studieremo nelle BFU-E e CFU-E da controlli e pazienti eritrocitosici, lo stato di alcuni vie di traduzione connesse con la proliferazione, e particolarmente, lo stato della via Ras->Raf->MAPK.