RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi di controllo dell’eritropoiesi e policitemie congenite e familiari: ruolo delle vie di risposta alla pressione di ossigeno

Università di riferimento

Seconda Università degli Studi di NAPOLI - PEDIATRIA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Silverio Perrotta

Descrizione

Risultati preliminari
Per l’arruolamento dei pazienti abbiamo utilizzato un algoritmo diagnostico per la policitemia, basato sulla concentrazione di Epo in pazienti pre-salasso (1).
Un questionario anonimo di due pagine su diagnosi e trattamento delle eritrocitosi congenite (ematocrito>0,50 negli uomini e >0,48 nelle donne) è stato inviato a tutti i membri (ematologi/oncologi pediatri) dell’AIEOP ( Associazione Italiana di Ematologia ed Oncologia Pediatrica) ed a numerosi membri (ematologi degli adulti) della SIE (Società Italiana di Ematologia). Questo rappresenta il primo e l’unico report nazionale sull’argomento.
Inizialmente abbiamo identificato 112 pazienti adulti (75 maschi; 37 femmine), suddivisi secondo l’algoritmo riportato precedentemente. Successivamente, 42 pazienti con sospetta policitemia tipo-Chuvash sono stati arruolati. L’età media dei pazienti alla diagnosi era di 25 anni (range:1-39). Alcuni pazienti erano sottoposti a sporadiche o regolari flebotomie.
Inizialmente 22 pazienti appartenenti a 13 famiglie con presunta policitemia tipo-Chuvash sono state analizzate (37), 12 pazienti vivevano ad Ischia. Tutti i casi analizzati sono stati reclutati tramite il Dipartimento di Pediatria (Seconda Università degli Studi di Napoli) e la divisione di Ematologia (Università degli Studi di Napoli Federico II e Seconda Università di Napoli). Per tutti i pazienti è stato ottenuto il consenso informato scritto per le indagini molecolari, l’analisi e la pubblicazione dei dati.
Lo studio dei 12 pazienti ischitani, appartenenti a 3 diverse famiglie, ha evidenziato tutti soggetti omozigoti per la mutazione C598T del gene VHL (37).
Abbiamo quindi analizzato la prevalenza della mutazione ad Ischia riscontrando una frequenza più alta di quella presente in Chuvaschia (9 eterozigoti su 64 soggetti donatori corrispondente ad una frequenza dello 0.0703). Quando, invece, siamo andati ad analizzare 60 soggetti provenienti da altre regioni italiane non abbiamo trovato alcuna mutazione nel gene VHL (37). Successivamente abbiamo analizzato l’aplotipo dei nostri pazienti osservando che è identico a quello presente in tutti i casi precedenti riportati con la mutazione VHL C598T (30).
L’identificazione di un nuovo cluster di policitemia ad Ischia suggerisce l’eventuale presenza di un vantaggio selettivo negli eterozigoti che favorirebbe la diffusione e il mantenimento dell’allele mutato.
Per dimostrare tale ipotesi, abbiamo messo a punto un saggio ELISA per identificare e quantizzare precisamente l’attività di HIF1alfa nei linfoblasti immortalizzati con l’EBV di soggetti normali, eterozigoti ed omozigoti. Abbiamo così dimostrato che l’attività di HIF1alfa è di circa tre volte più alta nei soggetti omozigoti rispetto ai controlli ed è statisticamente incrementata anche negli eterozigoti. Questa rappresenta la prima evidenza che gli eterozigoti presentano significative differenze biochimiche rispetto ai soggetti normali. Abbiamo anche quantizzato l’espressione dei geni target di HIF1alfa quali EPO, VEGF, SDF-1 e TP1, mediante real time PCR. L’espressione di VEGF è risultata aumentata negli omozigoti di circa tre volte mentre quella di EPO, SDF-1 e TP1 è risultata identica in tutti i campioni. I risultati ottenuti sull’espressione di EPO sono in disaccordo con quelli precedentemente riportati (20) che avevano dimostrato una aumenta regolazione di EPO nelle cellule linfoblastoidi dei pazienti Chuvashiani. Tale differenza può essere spiegata ipotizzando che le cellule linfoblastoidi normalmente non esprimono EPO mentre trascrivono efficacemente VEGF.
Abbiamo inoltre identificato tre pazienti policitemici, non correlati, eterozigoti per la mutazione C598T. In tutti e tre i casi, la mutazione C598T era stata ereditata dal padre, che, pur essendo eterozigote per la mutazione, non presentava alcuna caratteristica clinica o di laboratorio tipica della policitemia. Soltanto altri due casi di pazienti eterozigoti malati erano stati riportati in Letteratura (6). Per verificare l’eventuale presenza di altre aberrazioni genetiche sull’allele VHL wild-type, abbiamo inizialmente sequenziato il promotore del gene VHL senza trovare alcuna mutazione, e successivamente i trascritti di VHL (37) retrotrascrivendo l’RNA totale estratto delle cellule linfoblastoidi di due pazienti ed immortalizzate con EBV ed amplificando il cDNA con primers localizzati nella regione 5' e 3' UTR dell’RNAm. Questi esperimenti hanno evidenziato la presenza di due trascritti VHL full-lenght con simile efficacia. Siccome entrambi i pazienti eterozigoti presentano una Epo elevata, abbiamo ipotizzato la eventuale presenza di mutazione in un altro componente del pathway sensore dell’ossigeno, diverso da VHL, che contribuisca all’eritrocitosi, e per tale motivo, abbiamo screenato i geni HIF1alfa, elongin B e elongin C, senza però trovare alcuna mutazione. Abbiamo quindi concluso che una mutazione non ancora identificata in un altro step del pathway regolato da HIF1alfa possa essere responsabile della policitemia di questi eterozigoti.
Infine, Il fatto che i tre eterozigoti siano malati ci ha suggerito la possibilità che in questi casi l’allele normale di VHL fosse silenziato mediante metilazione e che l’allele alterato fosse iperespresso e che per tale motivo gli eterozigoti si comportano fenotipicamente come gli omozigoti. La real time PCR, però, ha evidenziato che gli alleli sono espressi allo stesso modo.

Fase 1
Caratterizzazione dei pazienti con policitemia congenita VHL dipendente nell’isola di Ischia.
Come riportato nella sezione dei dati preliminari, sebbene le policitemie congenite siano delle malattie abbastanza rare, abbiamo recentemente messo in evidenza un cluster esteso di policitemia tipo Chuvash nell’isola d’Ischia. Esso rappresenta il secondo cluster identificato al mondo e mostra una frequenza degli eterozigoti estremamente alta (> 0,07) simile a quella osservata in Chuvashia. La malattia è dovuta a un’alterazione del gene VHL che determina la produzione di una proteina VHL con un’affinità per il fattore trascrizionale HIF1alfa più bassa che si traduce in un livello di ubiquitinazione e degradazione di HIF1alfa ridotto. Ciò determina un’aumenta espressione dei geni target di HIF 1alfa che sono responsabili della policitemia.
I pazienti ischitani presentano caratteristiche cliniche differenti dal cluster Chuvashiano, compresa l’assenza (o una bassa incidenza) di eventi vascolari cerebrali. Quindi un’importante parte del progetto riguarderà il reclutamento di altri casi e di ulteriori informazioni cliniche sui pazienti ischitani. Inoltre, stiamo progettando di preparare una banca di linee cellulari di pazienti policitemici. In questa banca cellulare, includeremo non solo i casi di policitemia familiare e congenita ma tutti i casi italiani che presentano le caratteristiche cliniche riportate nell’ algoritmo precedentemente descritto. Un altro obiettivo di tale progetto sarà l’identificazione di geni che potrebbero essere responsabili del differente fenotipo osservato nel cluster ischitano rispetto a quello Chuvashiano.
Il lavoro sarà così organizzato:
1. le informazioni cliniche saranno ottenute da pediatri, ematologi, medici di famiglia di Ischia e/o da verbali medici, certificati di morte e/o da parenti e vicini di casa. Organizzeremo un meeting ad Ischia con medici di famiglia, medici dell’ospedale Lacco Ameno e con i Biologi del laboratorio di Ematologia. Per meglio paragonare le caratteristiche cliniche dei due cluster, utilizzeremo lo stesso questionario utilizzato per la popolazione Chuvashiana. Registreremo le caratteristiche cliniche e demografiche e le cause di morte. Nel caso di pazienti viventi e collaboranti, registreremo la storia clinica ed effettueremo una visita medica ed un prelievo di sangue venoso.
2. Estrarremo il DNA dai leucociti del sangue periferico ed analizzeremo la mutazione C598T di VHL.
3.Per caratterizzare piu’ precisamente il fenotipo policitemico valuteremo l’eventuale aumentata sensibilità dei progenitori eritroidi (BFU-Es) all’Epo utilizzando un saggio clonogenico in vitro.
Il saggio sara’ messo a punto in tutti i pazienti omozigoti per la mutazione C598T identificati .
4.Prepareremo linee cellulari linfoblastoidi degli eterozigoti e degli omozigoti per la mutazione C598T. In tal modo produrremo una banca di linee cellulari (incluse quelle di soggetti con eritrocitosi familiare). Attualmente abbiamo già preparato 10 diverse linee cellulari di pazienti policitemici. Il DNA estratto da tali cellule è di ottima qualità ed inoltre esse offrono l’opportunità di poter estrarre anche altre molecole come l’RNA e le proteine.
5. L’RNA sarà estratto dalle linee cellulari linfoblastoidi e dai progenitori eritroidi ed utilizzato per studiare l’espressione dei geni target di HIF1alfa mediante real time PCR. Allo scopo di identificare i geni responsabili di questo stato patologico sarà utilizzato l’RNA estratto da soggetti normali, da eterozigoti sani, da eterozigoti e omozigoti malati, mediante le tecniche precedentemente elencate. Ulteriori informazioni sui metodi ed i geni candidati si possono trovare nel documento allegato al progetto.
6. Per determinare altri geni target di HIF1alfa, le linee cellulari linfoblastoidi ed i progenitori eritroidi saranno sottoposti ad ipossia o esposti al cobalto. L’espressione genica verrà studiata mediante real time PCR.
7.Infine confronteremo i dati clinici e quelli relativi all’espressione genica tra la popolazione ischitana e quella Chuvashiana.

Fase 2.
Caratterizzazione dei pazienti con policitemia congenita tipo Chuvash in altre regioni italiane.
Un secondo obiettivo di questo progetto potrebbe essere l’identificazione di pazienti con policitemia congenita tipo Chuvash in altre regioni di Italia. Mentre abbiamo osservato che la policitemia ricorrente nell’isola di Ischia e’ dovuta esclusivamente alla mutazione classica C598T, gli altri casi che per adesso abbiamo osservato in Italia (sebbene la frequenza sia notevolmente più bassa) sono dovuti a nuove mutazioni nel gene VHL (doppi e singoli eterozigoti). Questi nuovi casi presentano un quadro clinico diverso rispetto a quello classico dell’omozigote per la mutazione C598T. Per determinare le basi genetiche di questi nuovi fenotipi, prepareremo le linee cellulari linfoblastoidi anche di questi pazienti.
Il lavoro sarà organizzato come segue:
1. effettueremo lo screening dell’intero gene VHL per determinare la presenza di nuove mutazioni
2. i soggetti omozigoti per la mutazione C598T identificati saranno analizzati secondo lo schema presentato nella fase 1. In particolare valutaremo se il quadro clinico e il profilo d’espressione genica dei pazienti sono simili a quelli dei pazienti ischitani e/o Chuvashiani.
3.i nuovi casi identificati saranno analizzati in maggiore dettaglio. Risultati preliminari hanno mostrato che sia i doppi eterozigoti che i singoli eterozigoti malati presentano caratteristiche cliniche più severe rispetto ai soggetti omozigoti per la mutazione C598T. Per studiare il rapporto genotipo-fenotipo forniremo i pellets delle linee cellulari linfoblastoidi e dei progenitori eritroidi dei soggetti omozigoti per la mutazione C598T, dei soggetti doppi eterozigoti e dei singoli eterozigoti al gruppo con cui collaboriamo, per valutare l’ attività della proteina HIF1alfa. I risultati di tali esperimenti dovrebbero aiutarci a comprendere meglio la relazione tra lo stato di HIF1alfa e le condizioni cliniche. Lo step successivo riguarderà la valutazione dell’espressione dei geni target di HIF1alfa nei modelli cellulari utilizzati.
4. Confronteremo i dati clinici e l’espressione dei geni target di HIF1alfa in questi pazienti allo scopo di identificare le basi molecolari del differente fenotipo clinico. Inoltre valuteremo il coinvolgimento dei geni responsabili della predisposizione tumorale della sindrome VHL in questo particolare sottogruppo di pazienti.

Fase 3
Pazienti policitemici con elevati livelli di Epo senza mutazioni VHL.
Esiste una percentuale significativa (nella nostra statistica>50%) di policitemie congenite con valori di Epo elevati (o relativamente elevati) senza alcuna alterazione del gene VHL, probabilmente dovute ad alterazioni nel patway sensore dell’ossigeno. Attualmente, già disponiamo di un significativo numero di questi pazienti, che abbiamo già caratterizzato clinicamente e dal punto di vista biochimico. In alcuni di questi pazienti, i livelli sierici di Epo sono addirittura di circa 50 volte superiori ai livelli normali.
Su questi pazienti, e su quelli che pianificheremo di arruolare, cercheremo altri possibili geni mutati, geni coinvolti nel patway sensore dell’ossigeno (inclusi elongin B e C, CUL2, RBX1, PHD1-3 e FIH). Inoltre procederemo all’immortalizzazione di cellule linfoblastoidi derivate da questi pazienti al fine di paragonare il loro profilo di espressione con quello delle policitemie VHL- dipendenti.
Inoltre procederemo come segue:
1) Valuteremo il fenotipo clinico di questi pazienti, per poter stabilire se i quadri clinici sono simili o meno a quelli dei pazienti con mutazioni VHL.
2) Inizialmente, utilizzeremo i linfociti periferici immortalizzati e le colonie dei progenitori eritroidi di questi pazienti e misureremo l’attività di HIF1 alfa mediante metodo ELISA ed immunoblotting (questo studio sarà effettuato dall'unità di Biochimica del Prof. Della Ragione).
3) Se l’attività di HIF1alfa è maggiore in questi pazienti che nei controlli, investigheremo la frequenza delle anormalità che potrebbero modificare l’espressione dell’allele VHL normale e produrre trascritti alterati .Per questa ragione noi sequenzieremo il promotore del gene VHL e ne analizzeremo i trascritti. Retrotrascriveremo tutto l’RNA estratto da linee cellulari linfoblastoidi ed amplificheremo il cDNA usando primers localizzati in posizione 5’ e 3’-UTR dell’ RNA messaggero di VHL.
4) Poiché questi pazienti policitemici hanno elevati livelli serici di Epo, è possibile che alterazioni genetiche di altri componenti del patway sensore dell’ossigeno piuttosto che VHL possano causare l’eritrocitosi. Di conseguenza , le regioni codificanti elongin B (16p12,3, esone3) e C (8q21,11, esone 3), CUL2 (10p11,2-p11,1, esone 21),, RBX1 (22q13,2, esone5), PHD1 (chr19q13,2, esone 5), PHD2 (chr1q24,1, esone5) e PHD3 (chr14q13,1, esone 5) saranno analizzate mediante sequenza utilizzando il metodo DHPLC.
5) Se non dovessimo trovare alcuna mutazione, il passo successivo sarà l’analisi dei profili d’espressione genica e poi l’analisi quantitativa mediante real time PCR, per l’ identificazione di nuovi geni candidati. L'identificazione di nuovi componenti del pathway HIF consentirà di chiarire ulteriormente l’intero sistema sensore dell’ossigeno, le cui alterazioni potrebbero determinare non solo un'aumento dell’ematocrito ma anche ad esempio un'alterata risposta all’altitudine.