RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi di controllo dell’eritropoiesi e policitemie congenite e familiari: ruolo delle vie di risposta alla pressione di ossigeno

Università di riferimento

Seconda Università degli Studi di NAPOLI - MEDICINA SPERIMENTALE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Francesca Rossi

Descrizione

Sulla base di quanto riportato nell’Intoduzione e delle interazioni con le altre unità, gli obiettivi di questa unità saranno i seguenti:

OBIETTIVO 1: Sviluppo di colture di cellule BFU-E e CFU-E da precursori eritroidi dal sangue periferico
OBIETTIVO 2: Identificazione e caratterizzazione di pazienti policitemici con recettore dell’Epo troncato
OBIETTIVO 3: Analisi delle vie di trasduzione alterate nei soggetti policitemici precedentemente identificati con recettore dell’Epo troncato.


PIANO SPERIMENTALE

OBIETTIVO 1: Sviluppo di colture di cellule BFU-E e CFU-E da precursori eritroidi dal sangue periferico

Lo sviluppo di colture di cellule BFU-E e CFU-E rappresenta un obiettivo essenziale del programma presentato. Di seguito è riportato in breve lo schema di preparazione che seguiremo. Risultato preliminari confermano che la metodologia è in grado di ottenere campioni arricchiti di una specifica popolazione.

1. Preparazione delle cellule
Cellule mononucleate del sangue periferico eparinizzate prelevate da volontari sani e da soggetti policitemici verranno isolate su di un gradiente Ficoll-Histopaque. I progenitori ematopoietici early CD34+ saranno separati mediante l’utilizzo del kit magnetico CD34+ (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Le cellule CD34+ saranno coltivate in Iscove’s modified Dulbecco’s medium contenente il 20% di siero fetale bovino (FBS) e supplementato con 20 ng/ml SCF, 3 IU/mL Epo, 1 ng/ml IL-3, desametasone (10-6 M) e estradiolo(10-6 M). Le cellule CD34+ saranno piastrate ad una concentrazione di 1 x 100.000 cellule /ml. Le colture saranno reincubate di tanto in tanto con un mezzo fresco per mantenere le cellule ad una concentrazione compresa tra 1-2 x 1.000.000 per ml. Per indurre la differenziazione in senso eritroide, le cellule saranno tolte dalla colture, lavate con IMDM e coltivate in IMDM fresco in presenza di 20% FCS, 1 u/ml EPO e 10 ng/ml insulina ricombinante umana. Dopo alcuni giorni (5-7 per le BFU-E, 10-14 per le CFU-E) le cellule saranno rimosse e caratterizzate fenotipicamente.
2) Analisi Fenotipica
La morfologia cellulare sarà analizzata sugli “smears” ottenuti in citocentrifuga e colorati con il metodo May-Grunwald-Giemsa, in accordo ai criteri standard.
Il profilo antigenico sarà valutato mediante l’analisi citofluorimetrica con un Coulter Elite ESP Cell Sorter, in accordo ai protocolli standard. Le cellule verranno risospese in un buffer salino privo di fosfato( PBS) supplementato con 1% albumina bovina sierica, 2 mM EDTA e 0,01% NaN3 e poi verranno incubate in ghiaccio con CD34 coniugato a ficoeritrina (PE) e CD71 coniugato alla fluoresceina isotiocinato (FITC) e anti-glicoforina A . Le cellule incubate con gli anticorpi legati ai corrispondenti isotopi verranno usate per determinare fluorescenza aspecifica e le cellule morte saranno escluse mediante l’utilizzo di propidio iodide.
I campioni ottenuti saranno impiegati per ii vari studi sia sviluppati da questa unità sia dalle altre unità del progetto.


OBIETTIVO 2: Identificazione e caratterizzazione di pazienti policitemici con recettore dell’Epo troncato

Di recente abbiamo identificato, una famiglia (due pazienti) affetti da eritrocitosi congenita che mostravano una alterazione del recettore dell’Epo (EpoR). La mutazione causava la perdita degli ultimi 80 amminoacidi. Fino ad ora, 8 mutazioni del gene EpoR sono state identificate e precisamente, transizione G>A in posizione 6002 (corrispondenta alla perdita di 70 aa), inserzione di G in posizione 5975 (perdita di 64 aa), delezione di 7 basi tra le posizioni 5975-5991 (perdita di 64), inserzione di T in posizione 5967 (perdita di 69 aa), transizione C>T in posizione 5986 (perdita di 74 aa), transizione C>G in posizione 5964 (perdita di 83 aa n), duplicazion in tandem diretto direct tra le posizioni 5968-5975 (perdita di 79 basi) e transizione G>T in posizione 5881 (perdita di 110 aa).

Nei nostri studi, comunque, abbiamo analizzato fino ad ora per le mutazioni di EpoR non più del 40% dei casi che abbiamo già raccolto e pertanto è completamente possibile che identificheremo altri pazienti con questa alterazione. Inoltre, noi abbiamo pianificato di ottenere ulteriori casi in base alla nostra collaborazione con l’AIOP e con la Società Italiana di Ematologia.
Per selezionare i casi da studiare, analizzeremo solo quei casi di policitemia congenita che non presentino alterazioni sia funzionali che genetiche delle vie di risposta alle variazioni della pressione di ossigeno. Questo screening iniziale sarà condotto dall’unità del dr. Fulvio Della Ragione (studi funzionali sui processi dipendenti dall’ossigeno, tra cui livelli ed attività di HIF1-alfa, ubiquitinazione e degradazione di HIF1-alfa, ecc.) e dall’unità del Dr. Silverio Per rotta (studi sulle alterazioni dei geni coinvolti nepathway di risposta all’ossigeno, VHL, HIF1-alfa, PHD ed altri).

In tutti i casi, come detto in precedenza, noi abbiamo già individuato una famiglia (due soggetti) con una mutazione del recettore di Epo che determina la perdita di 80 amminoacidi al C-terminale. In questi pazienti, noi investigheremo le maggiori caratteristiche di crescita e di differenziamento, poiché appare estremamente probabile che queste cellule crescano in presenza di quantità molte basse (oppure in assenza) di eritropoietina. Noi anche studieremo la dipendenza dei precursori eritrosi da altri fattori di crescita od ormoni (SCF e glucocorticoidi), quasi certamente coinvolti nel differenziamento eritroide.

Un secondo maggiore aspetto che sarà studiato è rappresentato dall’analisi dell’espressione del recettore mutato o normale. Questo obiettivo appare particolarmente interessante in quanto nessun dato è presente in letteratura relativamente alla presenza di un recettore tronco nei precursori eritroidi o in nessun altro tipo di cellula.

Inizialmente, mediante RT-PCR quantitativa, analizzeremo l’espressione relativa dei due alleli. Questo approccio ci darà informazioni sull’efficienza di trascrizione dei due alleli. Noi inoltre condurremo esperimenti di trascrizione in vitro (esperimenti di “run-on/run off”) impiegando preparazioni nucleari da cellule controllo e dai due pazienti disponibili. Infine, mediante trattatamento con actinomicina D, valuteremo l’emivita del trascritto normale ed alterato. Questo esperimento ci fornirà informazioni sulla possibile presenza di un differente metabolismo dei due diversi trascritti.

Nella seconda parte di questo obiettivo, mediante metodologie di immunoblotting, valuteremo la presenza della forma troncata del recettore cosiì come la sua localizzazione nella membrana cellulare. Infatti, finora, appare totalmente sconosciuto (in tutti i casi presenti in letteratura) se la proteina tronca sia stabile, se sia normalmente sintetizzata, maturata (il recettore è una glicoproteina) ed inserito normalmente nella membrana. Infatti, bisogna ricordare che la singola catena del recettore per l’Epo forma omodimeri o eterodimeri con c-Kit. Pertanto, sarà importante valutare se la forma tronca del recettore si associa: a) con la catena normale; b) con la forma tronca e, c) con c-Kit. E’ anche ipotizzabile che la catena alterata sia incapace di interagire con qualsiasi altra catena.

Tutte queste caratteriztiche non sono mai state studiate in precedenza nei pochi altri casi di recettori dell’Epo alterati descritti in Letteratura, lasciando pertanto il significato delle modifiche genetiche identificate completamente non chiarite dal punto di vista funzionale.


OBIETTIVO 3 Analisi delle vie di traduzione alterate nei soggetti policitemici con alterazioni del recettore dell’Epo.

In questa parte del progetto, affronteremo le problematiche relative agli aspetti molecolari attraverso i quali alterazioni del recettore dell’Epo influenzano la crescita ed il differenziamento dei precursori eritroidi.
Infatti come dettagliatamente spiegato nel Background, il dominio intracellulare del recettore dell’Epo (C-terminale) contiene 8 tirosine fosforilabili che fortemente influenzano l’interazione del recettore con i suoi vari effettori.

La parte iniziale di questa sezione sarà studiare l’effetto della mutazione sulle vie di trasduzioni attivate dal recettore dell’Epo. Come tutte le parti del progetto, impiegheremo precursori eritroidi (BFU-E e CFU-E) come sistema modello. E’ da sottolineare che i due pazienti con la mutazione del recettore dell’Epo sono soggetti a salassi ogni due settimane (anche di 400 ml) e pertanto, avremo sufficiente materiale per condurre tutti gli esperimenti pianificati.
La possibile attivazione costitutiva delle vie di trasduzioni derivanti dal recettore mutato dell’Epo, che determina l’effetto antiapoptotico tipico della stimolazione del recettore, sarà valutata analizzando alcuni degli effettori terminali di Stat5, ed in particolare Bcl-x, Pim-1, oncostatina M e SOCS-3.

Il ruolo di Bcl-x come molecola antiapoptotica e ben stabilito ed esso chiaramente corrisponde all’attività del recettore di epo stimolato. In aggiunta, Pim-1 può conferire resistenza alla rapamicina (un inibitore di mTOR) e può agire in parallelo con mTOR nel modulare eIF4E, un importante fattore nel differenziamento eritroide. Nel caso dell’oncostatina M, studi recenti rivelano una sua sostanziale espressione negli eritroblasti così come un effetto di sopravvivenza negli eritroblasti a stadi tardivi. Nel caso di topi deficienti di oncostatina M, è stato osservata una diminuzione di eritrociti circolanti.
Successivamente, la formazione di complessi tra il recettore e le proteine con effetti attivanti (particolarmente i complessi che includono Jak2 e Stat5) saranno valutati per immunoprecipitazione associata ad analisi per immunoblotting del materiale precipitato.

Oltre a valutare l’attivazione costitutiva delle vie che inducono un effetto antiapoptotico, studieremo gli effetti della mutazione del recettore sulle vie che spengono l’attivazione del recettore. In questo caso, l’attività di SHP-1 (che può defosforilare Jak2) saraà valutata così come i livelli di Cis-1. questo ultimo fattore può interferire con l’attivazione di Jak2 e/o di Stat5 e può anche dirigere i fattori della risposta attivatoria del recettore per l’ubiquitinazione.

Inoltre, l’assenza di interazioni tra EpoR e SHIP-1 sarà studiata seguendo la metodica già descritta che associa l’immunoprecipitazione e l’analisi dell’immunoprecipitato per immunoblotting impiegando anticorpi specifici.

Infine, investigheremo lo stato delle proteine che regolano il ciclo di divisione cellulare, paragonando campioni derivati da progenitori eritroidi di soggetti normali con quelli di soggetti affetti da mutazioni del recettore per l’Epo. Infatti, dati recenti suggeriscono che la modulazione dell’attività del recettore induce variazioni di alcune proteine fondamentali del ciclo cellulari, tra cui p27. Questa parte del progetto sarà condotta in collaborazione con l’unità del dr. Fulvio Della Ragione.