RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi patogenetici e manifestazioni cliniche della broncopneumopatia cronica ostruttiva

Università di riferimento

Università degli Studi di FERRARA - MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Piera Boschetto

Descrizione

Scopi della ricerca saranno misurare in un gruppo di soggetti sani non fumatori (controllo) ed in 15-20 pazienti per ogni stadio di gravità della BPCO, definito in base a criteri funzionali come da linee guida GOLD:
1. l’estensione dell’enfisema mediante metodo quantitativo con HRCT density-mask del torace
2. la concentrazione di elastasi neutrofila nel surnatante di espettorato indotto
3. il pattern proteico (proteomica) nel surnatante dell’espettorato indotto ed in un campione di urina; ed infine:
4. correlare l’estensione dell’enfisema con gli stadi di gravità della BPCO
5. correlare la concentrazione di elastasi neutrofila con l’estensione dell’enfisema e con gli stadi di gravità della BPCO
6. confrontare il pattern proteico dei campioni di sputo ed urine dei soggetti sani rispetto ai pazienti affetti da BPCO
7. correlare eventuali alterazioni del pattern proteico dei BPCO con l’estensione dell’enfisema e con gli stadi di gravità della BPCO.
I soggetti esaminati saranno un gruppo di soggetti sani non fumatori ed un gruppo di broncopneumopatici cronici, divisi per stadio di gravità della malattia in base al criterio funzionale. Il dosaggio dell’elastasi neutrofila nel surnatante dell’espettorato indotto sarà eseguito tramite metodo immunoenzimatico (EIA).
Gli studi di proteomica nell’espettorato indotto e nelle urine verranno eseguiti con spettrometria di massa.
Le cellule dell’espettorato indotto saranno quantificate con lettura al microscopio ottico.

Metodi

Soggetti
Ciascun soggetto sarà sottoposto ad una dettagliata storia clinica, questionario CECA per la bronchite cronica, questionario MMRC (modified Medical Research Council) per la gravità della dispnea, spirometria completa, test di reversibilità al broncodilatatore, HRCT del torace. Per ogni soggetto verranno raccolti 50 ml di urina del mattino che saranno congelati in freezer a –20°C.

Tomografia Computerizzata ad Alta Risoluzione
La Tomografia Computerizzata (TC) ad Alta Risoluzione del torace verrà eseguita con il Tomografo Computerizzato “Philips Tomoscan SR7000” a soggetto in inspirazione massimale. Non verrà usato il mezzo di contrasto. I parametri utilizzati saranno: spessore della scansione 1,5 mm, voltaggio 120 kV, corrente 175 mA, matrice 512 x 512 e tempo impiegato dal tubo radiogeno, per effettuare un giro di 360° per l’esecuzione di una scansione, pari a 2 secondi. Le scansioni verranno eseguite ogni 2 cm procedendo dagli apici alle basi del polmone.
Per ottenere una Density Mask verrà isolato il parenchima polmonare con una Roi Manual e tutte le scansioni saranno elaborate per mezzo di un programma detto Level Detect che calcola l’area con enfisema e i valori di attenuazione minimo, medio e massimo di ogni singola sezione.
Per una quantificazione oggettiva dell’enfisema misureremo la percentuale di area polmonare totale che presenta valori di attenuazione inferiori a –950 HU (Hounsfield Units) ed il valore medio di TC in HU che rappresenta la densità polmonare media (MLD).

Induzione e processazione dell’espettorato indotto
I pazienti saranno esposti ad una soluzione salina ipertonica al 4% per 20 minuti. L'aereosol verrà somministrato da un nebulizzatore ultrasonico. I soggetti saranno incoraggiati a tossire durante tutta la procedura che regolarmente verrà interrotta per consentire al paziente di espettorare in una capsula Petri. Dopo aver determinato il volume di sputo selezionato (libero da contaminazione salivare) vi verrà aggiunto ditiotreitolo (DTT) in concentrazione 0,1%, diluito in soluzione salina (PBS). I campioni verranno mescolati tramite un vortex mixer e lo sputo omogeneizzato sarà centrifugato a 3000 rpm per 3 minuti per separare il surnatante dal pellet cellulare. I surnatanti saranno poi aspirati e congelati a -80°C per le successive analisi biochimiche. Il pellet cellulare verrà risospeso in PBS. La conta cellulare totale e la vitalità cellulare saranno stimate con la metodica di esclusione mediante tripan-blu. Le cellule verranno citocentrifugate e colorate con il metodo Diff-Quick per eseguire la conta cellulare differenziale. Verranno contate almeno 400 cellule per vetrino ed il campione verrà considerato adeguato se la percentuale di cellule epiteliali squamose sarà più bassa del 20%. I risultati della conta cellulare differenziale verranno espressi come percentuale di cellule, escluse le epiteliali squamose.

Dosaggio dell’elastasi neutrofila nel surnatante dell’espettorato indotto
Il dosaggio della elastasi neutrofila nello sputo verrà effettuato mediante la tecnica della elettroforesi capillare. I surnatanti saranno incubati a 37°C con un substrato sintetico saturo (SucAla3NA). La reazione verrà interrotta mediante l’aggiunta di acido tricloroacetico 0.45M ed ogni campione sarà inserito nel sistema elettroforetico capillare. Per monitorare il decremento del peptide intatto e a la simultanea formazione dei prodotti di proteolisi verrà usato nella corsa elettroforetica un buffer sodio tetraborato 35mM a pH 9.3, contenente sodio dodecilsolfato 65mM e metanolo al 15%. La quantità del peptide intatto verrà determinata mediante aree “di picco”, convertite successivamente in quantità molari riferite ad aree di picco ottenute con quantità note di componenti standard.

Pattern proteico nell’espettorato indotto e nelle urine
Il pattern proteico nell’espettorato indotto e nelle urine sarà valutato mediante la tecnica MALDI-TOF-MS (spettrometro di massa con deassobimento/ionizzazione su matrice indotta da luce laser, interfacciata con analizzatori “a tempo di volo”).
I campioni saranno mescolati e centrifugati per 5 minuti a 10000 X g per rimuovere i detriti cellulari. I campioni verranno posti su una superficie contenente resine ad alta affinità per la cattura di proteine (chips), e successivamente lavate da eventuali impurità. Gli analiti verranno deassorbiti e ionizzati direttamente sul chip ed analizzati mediante uno spettometro di massa.