RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi patogenetici e manifestazioni cliniche della broncopneumopatia cronica ostruttiva

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - Anatomia patologica - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Fiorella Calabrese

Descrizione

Il programma di ricerca della nostra Unità Operativa è rivolto essenzialmente allo studio di alcuni substrati patologici ed eziopatogenetici di differenti forme di BPCO in fase avanzata di pazienti sottoposti a trapianto di polmone. In particolare il principale obiettivo del nostro studio sarà quello di identificare alterazioni morfologiche e specifici fattori eziopatogenetici che possono contribuire(a parità di fattori di rischio conosciuti: fumo di sigaretta e deficit di alpha-1-antitripsina) ad influenzare il decorso della malattia. Non sono infatti ancora noti quali siano i substrati patogenetici che influenzano sensibilmente il decorso della malattia ponendo in una condizione di irreversibilità pazienti con insorgenza della malattia da un periodo relativamente breve (<10 anni).
I compiti della nostra Unità si possono così sintetizzare:
1)Esatta caratterizzazione morfologica delle varie forme di BPCO
2) Rilevazione di sequenze genomiche virali con elettivo tropismo per le vie aeree come possibili fattori eziologici.
3) Individuazione del ruolo patogenetico delle citochine TNF alpha e TGF beta 1
La nostra Unità Operativa si propone di sviluppare la propria ricerca sia in maniera retrospettiva (a) che prospettica (b).
Prelievi congelati e fissati sono stati e sono a tutt'oggi eseguiti su ogni polmone nativo espiantato e costituiscono una esauriente banca di tessuti.
In particolare per la ricerca verranno studiati: a) 21 polmoni nativi di pazienti con diagnosi di BPCO (di cui 6 con associato deficit da alpha-1-antitripsina) sottoposti a trapianto di polmone nel nostro Centro negli anni 1995-2002 b)5 nuovi casi prevedibili nei prossimi 2 anni.
Polmoni di donatori (20 casi) non utilizzati per il trapianto (nei casi di trapianto di un singolo polmone) rappresenteranno la nostra popolazione di controllo.
Studio Morfologico:
In ciascun polmone appena rimosso vengono effettuati dei prelievi conservativi di 3-4 mm cubi (2 per ciascun lobo):1 immediatamente congelato in azoto liquido destinato agli studi molecolari non in situ ed 1 fissato in karnoski per l'analisi ultrastrutturale.
Ciascun polmone nativo viene successivamente perfuso con paraformaldeide al 4% per via endobronchiale alla pressione costante di 25 cm di acqua. Dopo 48 ore di fissazione vengono eseguite per ciascun lobo almeno 3 prelievi (due a sede subpleurica ed uno più centrale)che vengono inclusi in paraffina come di routine. Ciascun prelievo viene destinato allo studio istologico, immunoistochimico e molecolare in situ.
a) Analisi istologica:
Le sezioni istologiche sono colorate oltre che con l'ematossilina eosina anche con la pentacromica di Masson e fibre elastiche Van Gieson. Lo studio istologico è indirizzato innanzitutto ad una esatta caratterizzazione del processo patologico alla base della malattia :
-tipo di enfisema (centroacinare,panacinare, irregolare etc)
-tipo di di bronchite/bronchiolite (follicolare, costrittiva, obliterativa)
-indice di Reid
-patologia vascolare
-displasia epiteliale
-fibrosi peribronchiale ed interstiziale
Per ciascun parametro verrà data una valutazione descrittiva in termini semiquantitativi o quantitativi.
Per quanto concerne lo studio istologico retrospettivo questo consisterà essenzialmente nella valutazione dei parametri sopraelencati di preparati istologici già disponibili.
b) Analisi ultrastrutturale:
Per lo studio ultrastrutturale sono previste sia inclusioni in resine epossidiche che acriliche al fine di garantire un possibile approfondimento con tecniche di immunoelettromicroscopia. L'analisi al microscopio elettronico (TEM Hitachi 7000) è rivolto soprattutto allo studio dell'epitelio bronchiale/bronchiolare (membrana citoplasmatica, apparato secretorio,organelli intracitoplasmatici, nucleo e nucleolo) e alle caratteristiche della matrice extracellulare.
Per quanto concerne lo studio retrospettivo le alterazioni subcellulari sopra riferiti saranno valutati su preparati già disponibili
c) Studio immunoistochimico:
La tecnica immunoistochimica sarà utilizzata per:
a)caratterizzazione immunofenotipica dell'infiltrato infiammatorio (CD45,CD45RO, CD4,CD8,CD20,CD68,CD43,CD 79a e CD31);
b)identificazione di due citochine e dei rispettivi recettori:1) citochina proinfiammatoria TNF alpha e dei suoi recettori RI ed RII 2)citochina profibrogenetica/antiinfiammatoria TGF beta e dei suoi recettori RI ed RII;
c) espressione tissutale della proteina SCCA (varianti 1, 2 e PD)
Studio Molecolare:
Come tecnica molecolare in situ verrà utilizzata la metodica TUNEL per l'evidenziazione del fenomeno apoptotico. Verrà calcolato l'indice apoptotico riferito sia alle cellule interstiziali che parenchimali
Verranno utilizzate tecniche molecolari di amplificazione genica (Polymerase chain reaction-PCR- o Reverse Transcriptase-RT-PCR) per: 1) la ricerca di sequenze genomiche virali con noto tropismo per le vie aeree: picornavirus, coronavirus, adenovirus, inflenza e parainfluenzavirus e virus respiratorio sinciziale. Eventuali amplificati positivi per genomi virali verranno caratterizzati con analisi di sequenza; 2)la ricerca dell'espressione delle citochine TNF alfa e TGF beta e dell'mRNA della proteina SCCA. Di entrambe le citochine e della proteina SCCA sarà data una valutazione anche in termini quantitativi (PCR quantitativa -real time PCR- mediante l'uso di ABI PRISM 7000).
Sia lo studio immunoistochimico che molecolare verrà eseguito de novo sia sui casi archiviati (95-2000) che su i nuovi casi reclutati.
Correlazioni clinico-patologiche:
Tutte i dati morfologici, immunoistochimici e molecolari verranno correlati ai dati clinici e funzionali dei singoli pazienti.
I risultati prevedibili dal raggiungimento degli obiettivi che si propone la nostra Unità Operativa sono:
1)Correlare il tipo di infiammazione (bronchite e brochiolite) e le varie tipologie di rimodellamento del parenchima alveolare (tipi di enfisema, vasculopatia) con le differenti forme di BPCO prospettando una migliore classificazione clinico-patologica
2) Individuare i fattori eziopatogenetici e le alterazioni morfologiche più frequentemente associate con le forme di BPCO a decorso più rapido e progressivo
3)L'identificazione del possibile ruolo eziologico di agenti infettivi virali e del ruolo patogenetico delle citochine TNF alfa e TGF-beta e della proteina SCCA consentirà sulla scorta delle correlazioni clinico-patologiche di individuare e prospettare per la malattia: a) nuovi fattori prognostici b)differenti strategie terapeutiche.