RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Effetti di rosiglitazone e metformina sullo sviluppo e la progressione dell'insufficienza cardiaca cronica in un modello di insulino-resistenza e scompenso cardiaco

Università di riferimento

Università degli Studi di NAPOLI "Federico II" - MEDICINA CLINICA E SCIENZE CARDIOVASCOLARI E IMMUNOLOGICHE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Luigi Saccà

Descrizione

Gli esperimenti verranno condotti nei ratti spontaneamente ipertesi, obesi, predisposti all’insufficienza cardiaca (modello SHHF), che rappresentano un modello congenito di ipertensione e insulino-resistenza. Questi animali sviluppano un’ipertrofia cardiaca compensatoria tra i 6 e gli 8 mesi di vita, con funzione cardiaca conservata. Successivamente, si verifica il rimodellamento del ventricolo sinistro, con progressione verso la cardiomiopatia dilatativa, disfunzione contrattile severa e insufficienza cardiaca scompensata. Gli animali SHHF saranno acquistati da Charles River all’età di 8 mesi e stabulati in un ambiente tenuto stabilmente a 22° C, con un ciclo luce-buio 12:12 artificiale. Dopo 2 settimane di acclimatamento, i ratti verranno assegnati a caso a tre gruppi sperimentali: controlli non trattati (UN), rosiglitazone (RO) e rosiglitazone più metformina (RM). Venti ratti saranno usati per ciascun gruppo. Gli animali mangeranno o mangime Purina 5008 o mangime addizionato con rosiglitazone (2 mg/die) o mangime con rosiglitazone più metformina (250 mg/die). Per valutare in vivo la funzione e la morfologia ventricolare sinistra, in condizioni basali (prima del trattamento) e ogni due mesi dal quel momento in poi, fino all’età di 15 mesi (fine dello studio) si effettuerà una valutazione ecocardiografica. Per valutare l’emodinamica del ventricolo sinistro (LV) e la contrattilità alla fine dello studio, i ratti verranno anestetizzati e un catetere sarà posizionato nel LV. In un sottogruppo di ratti, i parametri emodinamici verranno valutati nel cuore isolato e per fuso. Tessuto miocardio sarà rimosso e preparato per la valutazione istologica e per studi molecolari. Campioni di sangue saranno prelevati alla fine dello studio per la determinazione di parametri infiammatori (TNF-alpha, IL-6) e di rimodellamento LV (ANF, BNP, ACE, Aldosterone, Nor-Epinephrine).
Echocardiografia. Verranno effettuati ecocardiogrammi transtoracici in tutti gli animali ogni 2 mesi. Precedenti lavori dal nostro laboratorio (19,20) hanno dimostrato l’accuratezza e la riproducibilità dell’ecocardiografia transtoracica nei ratti per misurare la funzione del LV e le sue dimensioni. In breve, i ratti verranno anestetizzati con una combinazione di ketamina HCl 50 mg/kg (Parke Davis, Morris Plains, NJ) e xylazina 10 mg/kg i.p. (Lloyd Laboratories, Shenandoa, IO) e collocati su un apparato appositamente costruito. Gli ecocardiogrammi verranno effettuati mantenendo l’animale in posizione prona con uno ecocardiografo Hewlett-Packard Sonos 5500 (Hewlett-Packard, Andover, MA) equipaggiato con un trasduttore 15 MHz. Una traccia M-mode e bidimensionale sarà registrata con un registratore a carta alla velocità di 100 mm/s. Lo spessore della parete posteriore e le dimensioni interne del LV saranno misurate secondo il metodo suggerito dall’ American Society of Echocardiography. Il diametro del tratto di efflusso del LV sarà misurato su un fotogramma bidimensionale alla base della valvola aortica in una proiezione parasternale. Tutte le misurazioni effettuate con un sistema di analisi off-line (Cardiac Workstation, Freeland Systems, Louisville, CO) da un osservatore cieco dei risultati precedenti, saranno basate sulla media di tre cicli cardiaci consecutivi. Registrazioni Doppler-guidate bidimensionali dell’afflusso del LV saranno ottenute dalla proiezione apicale quattro camere. La posizione del volume campione sarà ottimizzata per ottenere le velocità di flusso diastolico massimali con la migliore definizione dell’onda, senza correzione di angolo. Le registrazioni Doppler saranno effettuate su carta alla velocità di 100 mm/s e analizzate off-line. Misurazioni saranno effettuate su sei cicli consecutivi per minimizzare la variabilità fra i battiti. Le velocità proto- e tele-diastoliche saranno calcolate dalla velocità di influsso mitralico, mentre la velocimetria del tratto di efflusso del LV sarà registrata dalla proiezione 5-camere apicale.
Cuore isolato e perfuso. Un addizionale sottogruppo di ratti (6 per ciascun gruppo) sarà sacrificato e i cuori isolati saranno montati in un sistema di perfusione secondo la tecnica di Langendorff, come precedentemente descritto (21,22). Misurazioni della funzione LV saranno ottenute quando la preparazione avrà raggiunto le condizioni stazionarie (15 min circa) alla pressione diastolica di 10 mmHg. Sia i valori assoluti della pressione sviluppata che normalizzata per il peso del LV saranno valutati.
Immunoistochimica e istologia morfometrica. I cuori verranno rapidamente rimossi, esaminati microscopicamente, quindi immersi e fissati in formalina al 4% e trasferiti in paraffina (21,22). I ventricoli saranno tagliati in sezioni traverse seriali spesse 1 mm, dall’apice alla base. Le sezioni saranno successivamente colorate con I seguenti metodi: 1) ematossilina cosina; 2) colorazione di Mallory; 3) rosso picrosirio. Sezioni parallele saranno immunostained con antisieri policlonali anti collagene I e III umani (Monosan, Uden, The Netherlands) secondo una tecnica standard biotina-perossidasi. Siero di ratto normale sarà usato come controllo negativo. Le strisce saranno guardate con microscopio Nikon Microphot FXA equipaggiato con software Zeiss KS300.
In ogni animale verranno misurati i seguenti parametri dalle sezioni traverse: 1) diametro dei cardiomiociti (ematossilina-eosina, 50 campi per animale); 2) frazione di volume del collagene (CVF) (colorazione rosso picrosirio e Collagene I and III immuno, 40X ingrandimenti, 50 campi per animale); CVF sarà espressa come la media percentuale delle aree di tessuto connettivo diviso per l’area totale in quel campo; 3) densità capillare misurata come numero di capillari per mm2(staining GSLI); 4) collagene perivascolare, quantificato come descritto in precedenza. Le isoforme di collagene I e III saranno misurate anche con elettroforesi SDS-PAGE.
Apoptosi dei cardiomiociti. Saranno utilizzati tre metodi indipendenti per valutare l’apoptosi dei cardiomiociti: 1) il terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL); 2) immunoistochimica per la misurazione della attività della caspasi-3 activity; e 3) DNA laddering by agarose gel elctrophoresis (22,23).
RT-PCR quantitativa. L’RNA verrà estratto dal tessuto cardiaco congelato usando Totally RNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX) e il saggio sarà effettuato con 20 µg di RNA totale. Sarà determinata l’espressione genica dei seguenti geni: SERCA2, Cox2, OPN, TNF-alpha, IL-6, ICAM-1, VCAM-1, ANF, BNP, ET-1, ACE, MHC-alpha, MHC-beta, TGF-beta, fibronectina e metalloproteinasi.

Gli effetti dei TZDs sul cuore sono stati oggetto di numerosi studi. La maggior parte di questi soffre delle limitazioni legate agli esperimenti acuti effettuati sul cuore isolato e perfuso e sul modello ischemia-riperfusione. Chiaramente, in queste condizioni TZDs hanno una ridotta possibilità di esprimere al massimo i loro effetti, data la impossibilità di TZDs di modificare l’ambiente metabolico come invece fanno nella realtà. D’altra parte, poca attenzione si è concentrata sugli effetti di TZDs sulla progressione dell’insufficienza cardiaca e ancora meno sulla questione cruciale se TZDs impattano la biologia del CHF nei pazienti diabetici o con severa insulino-resistenza. Il presente approccio ha le possibilità di fornire nuovi dati riguardanti il ruolo dei TZDs nel CHF. Questi dati hanno le possibilità di fornire informazioni di rilevanza clinica in relazione all’attuale dibattito dell’uso di TZDs in diabetici con CHF. Altro aspetto importante è la valutazione degli effetti combinati della terapia con TZDs e metformina. Questo è particolarmente rilevante in considerazione dell’aumento dell’uso combinato dei due farmaci e della carenza di dati sull’uomo sulgli effetti sulla progressione del CHF.