RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Patogenesi molecolare ed evoluzione clinica delle miopatie dei cingoli

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - NEUROSCIENZE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Corrado Angelini

Descrizione

Nella nostra banca di tessuti sono raccolti oltre 6000 casi di pazienti con malattie neuromuscolari, tra queste circa 600 biopsie di pazienti possono essere identificate con queste caratteristiche:
1. biopsia miopatica o distrofica (con normale distrofina)
2. elevata CPK (> 500 U/l)
3. debolezza muscolare progressiva
Selezionando con tali criteri dalla nostra banca di tessuti i casi di biopsie con distrofie dei cingoli e miopatie prossimali e distali da classificarsi è quindi possibile compiere uno studio di screening e di analisi ulteriore sia del difetto proteico che delle mutazioni del DNA in tali pazienti.
Ci proponiamo di seguire la seguente metodologia.
A. Screening di tali biopsie con immunoistochimica utilizzando una serie di anticorpi commerciali od in dotazione presso il nostro laboratorio, ed ottenuti tramite collaborazioni nazionali od internazionali cioè: anticorpi antidisferlina, anticorpi anticaveolina ed anticorpi antiteletonina, anticorpi contro alpha2-laminina,alfa-sarcoglicano(anticorpi Novocastra), inoltre utilizzare anticorpi contro la seguente glicoproteina: alfa–distroglicano (collaborazione con Dr. Campbell, Iowa, USA).
B. Nella seconda fase seguirà uno studio delle proteine con western blot per calpaina, alfa-sarcoglicano, disferlina, caveolina-3, merosina, come descritto dal nostro gruppo (Fanin et al., 2003)
C. Nei casi deficitari sarà eseguito uno studio delle mutazioni mediante retrotrascrizione del RNA muscolare, studio dei conformers SSCP e sequenziamento diretto dei conformers al CRIBI. Alternativamente si utilizzerà il DNA genomico ottenuto da linfociti dei pazienti che sarà studiato con D-HPLC. Questo approccio appare particolarmente utile per i casi di calpainopatia (LGMD 2A), in cui oltre 150 diverse mutazioni sono state riconosciute (Richard et al., 1995) di cui nel nostro laboratorio circa 30 nuove o LGMD 2I da difetto di fukutin related protein (FKRP) e lamina A/C (LGMD 1B).
D. Studi di microarray saranno condotti nei casi identificati molecolarmente di difetto di caveolina, calpaina, merosina (CMD1A), FKRP(LGMD2I) in collaborazione con il dr. Lanfranchi, con cui abbiamo già compiuto studi nella distrofia dei cingoli 2B (Campanaro et al., 2002). Nella seconda fase studieremo il profilo di biopsie dei difetti di laminina A/C (LGMD1B) e sarcoglicanopatie (LGMD2D-2F). Una delle maggiori difficoltà negli studi di espressione genica sarà quella di distinguere tra alterazioni comuni ai vari tipi di distrofie dovute a necrosi, degenerazione, rigenerazione dalle alterazioni specifiche di ogni patologia. Con una tecnica statistica di raggruppamento gerarchico (hierarchical clustering) questo potrà essere ottenuto dall'espressione genica nei singoli pazienti. Una alternativa per comprendere ciò che è primario e ciò che è secondario nei vari tipi di distrofia è quello di utilizzare come possibile chiave interpretativa in ogni esperimento di microarray i geni sovra o sotto epressi a livello di RNA e tornare poi al profilo clinico-patologico del singolo paziente e della singola biopsia.
E. A questa fase di ricerca in laboratorio seguirà quindi una rivalutazione clinica con uno studio analitico del fenotipo clinico che sarà svolta mediante un protocollo da noi approntato che prevede per ogni paziente l’esecuzione di: 1) scala di protocolli con valutazione funzionale; 2)valutazione della forza dei singoli gruppi muscolari con scala MRC (Medical Research Council, in 5 gradi); 3) valutazione cardiologica; 4)RMN muscolare: questo verrà quantificata con analisi dei singoli gruppi muscolari; 5) valutazione degli aspetti cognitivi e della qualità di vita da parte di uno psicologo (SF36). Lo scopo sarà di ottenere dei dati sia di storia naturale dei singoli fenotipi clinici, stabilire il coinvolgimento muscolare e cardiaco nelle singole forme di distrofia dei cingoli e correlarli con i dati di mutazione di proteina ed i risultati di espressione genica con microarray. Un gruppo collaborativo con diverse competenze si è andato formando tra clinici, statistici e biologi molecolari al fine di raccogliere ed interpretare un gran numero di dati ricavati dall'espressione genica e per definire gli ulteriori eperimenti per validare i dati ed analizzare statisticamente quelli necessari per la corretta comprensione della grande quantità di dati generati da queste nuove tecnologie.