RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Patogenesi molecolare ed evoluzione clinica delle miopatie dei cingoli

Università di riferimento

Università degli Studi di MESSINA - NEUROSCIENZE, SCIENZE PSICHIATRICHE E ANESTESIOLOGICHE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Antonio Toscano

Descrizione

Negli ultimi 20 anni il nostro Centro per le Malattie Neuromuscolari ha avuto l'opportunità di studiare numerosi pazienti con malattie neuromuscolari divenendo il centro di riferimento del Sud Italia per tali patologie. Alla luce delle recenti acquisizioni genetiche e biochimiche nella diagnostica delle distrofie muscolari dei cingoli, negli ultimi 5 anni, abbiamo posto particolare attenzione ai pazienti con fenotipo muscolare tipo cingoli e con deficit di calpaina 3 primario e verso pazienti con altre malattie muscolari con deficit secondario di calpaina 3. Abbiamo pertanto identificato circa 50 pazienti con deficit di calpaina 3 tra le forme primarie e secondarie.

OBIETTIVI
1. Identificazione dell'espressione genica a livello muscolare mediante metodica di microarray in pazienti con deficit di calpaina 3, geneticamente determinato (LGMD2A), o secondario ad altre patologie neuromuscolari, allo scopo di selezionare i geni coinvolti nella patogenesi del danno muscolare.
2. Studiare l'espressione a livello muscolare dei microRNA (miRNA) nei pazienti con deficit di calpaina primario e secondario per stabilire l'eventuale ruolo dei miRNA nella patogenesi delle calpainopatie. Correlare poi i risultati con gli aspetti fenotipici delle calpainopatie.


METODOLOGIA
Per compiere gli studi relativi al nostro programma di ricerca, utilizzeremo le biopsie muscolari di pazienti con deficit primario e secondario di calpaina già diagnosticati presso il nostro Centro per le Malattie Neuromuscolari. Noi contiamo di avere almeno 30 campioni di deficit primario di calpaina e circa 20 da deficit secondari ad altre patologie neuromuscolari.

ANALISI GENETICA DEL GENE CAPN3
Il DNA genomico è stato estratto da sangue secondo protocollo standard.
L'intera regione codificante comprese le regioni introniche adiacenti del gene CAPN3 sono state amplificate mediante PCR. I prodotti di PCR ottenuti sono stati studiati con metodica SSCP al fine di identificare alleli mutati. Le varianti elettroforetiche identificate verranno sequenziate mediante sequenziatore automatico al fine di mettere in evidenza il tipo di mutazione.

PROFILO DELL'ESPRESSIONE GENICA MEDIANTE MICROARRAYS

ESTRAZIONE DEL RNA TOTALE:
L'RNA totale verrà estratto da singole biopsie di muscolo precedentemente congelate in isopentano raffreddato in azoto liquido, conservate a 80 °C utilizzando il TRIzol reagent (Invitrogen) seguito da un trattamento con la DNAsi e poi purificato con Mini kit (Qiagen). La concentrazione dell'RNA totale e il rapporto di purezza saranno determinati spettrofotometricamente, mentre l'integrità verrà determinata con Agilent Bioanalyzer.
IBRIDIZZAZIONE DEI MICROARRAYS:
Sarà utilizzata, per la sintesi del single strand DNA (ssDNA), la tecnica del two-step aminoallyl, la quale impiega un nucleotide legato ad un gruppo aminoallilico che funge da recettore per i fluorocromi e che quindi consente di aumentare la quantità dei fluorocromi incorporati (Ambion).
In un prima fase, con una miscela reattiva contenente oligo d(T15-20) e la superscript II (Ambion), vi è la formazione del cDNA incorporando casualmente i nucleotidi con e senza aminoallil.
Il cDNA formato viene lavato e purificato in micro-colonne (Quick kit-Qiagen), poi quantificato; due aliquote del singolo campione vengono marcate distintamente: un'aliquota cDNA-paziente viene marcata con il fluorocromo Cy3, mentre un'altra con il fluocromo Cy5; la stessa procedura viene effettuata anche per il cDNA controllo. La doppia marcatura consente di realizzare il cosiddetto processo swapping; con il quale si può convalidare la validità dell'espressione del singolo spot in doppia marcatura. <br />Una miscela di ibridizzazione contenente cDNA-paziente-Cy3 e cDNA-Controllo-Cy5 e viceversa vengono ibridizzate per 17 ore a 65 °C su un Microchip contenente 40.000 geni codificanti per l'intero genoma umano (Agilent Technologies).
I microchips vengono lavati e poi sottoposti a lettura con un scanner confocale Agilent. Un'analisi preliminare per l'estrazione dei dati dalle immagini acquisite viene eseguita per mezzo del Extraction Data Software (Agilent Technologies). Tali dati saranno infine sottoposti ad un'analisi statistica, per confermare la validità dei risultati.

VALIDAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA CON LA REAL TIME-PCR QUANTITATIVA:
3 microg di RNA totale di ogni campione viene retrotrascritta con la metodica del kit Archive (Applied Biosystems, Milano). Il cDNA generato è utilizzato per l'analisi dell'espressione genica mediante real time PCR (Applied Biosystems). In breve, la miscela reattiva contiene dei primers specifici non marcati ed una sonda Taq Man MGB (FAM dye-marcata) altamente specifica alla sequenza interna del tratto genico che si desidera amplificare. Il Reporter della sonda è un fluorocromo FAM in posizione 5'; mentre il Quencher è una sequenza MGB in posizione 3'. Durante la fase d'estensione della PCR, l'attività esonucleasica 5'; della Taq polimerasi, impiegata per l'amplificazione, taglia la sonda liberando cosi il reporter (FAM). Ad ogni ciclo della PCR è un aumento di fluorescenza che viene monitorata con lo strumento Applied 7300. Alcune geni che hanno una sopra- o sotto-espressione saranno valutati per confermare i risultati dei microarrays. L'espressione genica dell'actina (4326315 E.) sarà utilizzata come gene endogeno, dosata simultaneamente al gene in questione nella stessa multiplex per normalizzare l'espressione genica. In un volume finale di 50 microl di reazione multiplex contenente: 2,5 microl di cDNA + assay del gene da dosare diluito 1:20. La reazione sarà programmata con il seguente programma di amplificazione.: Stage 1: 50°C per 2 min, Stage 2: 95°C per 10 min, Stage 3: 95°C per15 sec ed infine Stage 4: 60°C per 1 min.
La metodica comparativa cycle threshold (Ct) (Applera) sarà utilizzata per l'analisi dei risultati generati dallo strumento sul relativo valore del cDNA target. La quantificazione relativa (RQ) di tale gene viene espressa in quante volte il gene in questione è più o meno espresso rispetto al gene endogeno. Questa strategia di calcolo utilizza la metodica DDCt usando i controlli sani come calibratori.
ESPRESSIONE DEI MIRNAS
Studio dell'espressione dei MiRNAs mediante metodica microarray
Le piastre miRNAGeneChips contengono circa 245 miRNA umani e murini identificati da saondo triplicate coinvolti in vari pathways ed espressi in vari tessuti. Le sonde utilizzate sono oligonucleotidi di circa 40 bp che vengono iniettate nella piastra (Agilent Technologies).
Ogni campione verrà analizzato in doppio e sarà coibridizzato con RNA totale umano usato come controllo (Stratagen) mediante il metodo "dye-swapping".

VALIDAZIONE DELL'ESPRESSIONE DEI miRNA CON REAL TIME-PCR QUANTITATIVA
Reazioni di trascrizione inversa
La trascrizione inversa di campioni di RNA purificato verrà effettuata mediante l'utilizzo di primers particolari (stem-loop RT primer) (P/N: 4365386 and 4365387, Applied Biosystems), 0.25mM di dNTPs, 3.33 U/ml MultiScribe trascrittasi inversa (P/N: 4319983, Applied Biosystems) and 0.25 U/ml di nibitore della Rnase (P/N: N8080119; Applied Biosystems). 7.5 ml della reazione verranno incubati in Applied Biosystems 9700 Thermocycler in piastre di 96- or 384-pozzetti per 30 min a 160C, 30 min, a 420C, 5 min a 850C e mantenuti a 4°C. Tutte le reazioni verranno condotte in doppio.
I risultati ottenuti mediante lo studio dei miRNA verrano statisticamente correlati con gli aspetti fenotipici dei pazienti con calpainopatia (insorgenza della malattia, durata, severita', elevazione del CK, aspetti morfologici)