RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Patogenesi molecolare ed evoluzione clinica delle miopatie dei cingoli

Università di riferimento

Università degli Studi di TORINO - NEUROSCIENZE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Laura Palmucci

Descrizione

Lo studio prevede il riesame della casistica del Centro per le Malattie Neuromuscolari di Torino alla ricerca di pazienti con deficit di lamina per la miglior definizione dell'espressione clinico-patologica della malattia e per una correlazione genotipo-fenotipo. L'attuale casistica si avvale di pazienti biopsiati presso il Centro suddetto e le cui biopsie tessutali sono state conservate in azoto liquido dal 1985 ad oggi: sono disponibili oltre 1500 biopsie di muscolo e oltre 200 biopsie di nervo periferico. Oltre allo studio retrospettivo della casistica saranno presi in considerazione pazienti nuovi venuti all'osservazione e sottoposti a biopsia nel corso dello studio per un totale previsto di circa 100 biopsie muscolari e 20 biopsie di nervo periferico all'anno.
Verranno presi in considerazione i seguenti tipi di paziente:
1. miopatie dei cingoli in cui siano stati esclusi difetti di altre proteine (distrofina, alfa-sarcoglicano, beta-sarcoglicano, gamma-sarcoglicano, delta-sarcoglicano, emerina, caveolina, merosina, alfa-distroglicano, collagene VI, calpaina, disferlina) ed in cui l'anamnesi suggerisca una patologia ereditaria autosomica dominante o recessiva o in cui l'anamnesi familiare sia negativa per malattie neuromuscolari;
2. miopatie associate a cardiomiopatia dilatativa in cui siano state escluse altre cause di patologia (distrofinopatie, distrofie miotoniche, malattie mitocondriali);
3. miopatie associate a disturbi di conduzione cardiaca atrio-ventricolare, in cui siano state escluse altre patologie muscolari quali distrofie miotoniche, mitocondriopatie e deficit di emerina;
4. cardiomiopatie isolate, senza deficit della forza muscolare, sia di tipo dilatativo che con blocchi della conduzione cardiaca atrio-ventricolare, sia sporadiche che familiari;
5. miopatie con blocchi articolari e/o retrazioni tendinee precoci, con o senza cardiomiopatia associata;
6. sindrome della spina rigida con o senza debolezza muscolare, con o senza cardiomiopatia associata;
7. polineuropatie a prevalente componente assonale, in cui siano state escluse cause esogene o metaboliche;
8. casi di iperCKemia familiare.

Sulle biopsie muscolari conservate in azoto in cui non sia stato ancora fatto o nei nuovi casi sarà eseguito lo studio immunoistochimico con anticorpi monoclonali contro la distrofina (dominio C-terminale ed N-terminale), i sarcoglicani alfa, beta, gamma e delta, contro emerina e caveolina, contro alfa-distroglicano e collagene VI e lo studio immunoelettroforetico con Western blotting con anticorpi contro la porzione centrale della distrofina (ed eventualmente anche il dominio C-terminale) e contro calpaina e disferlina allo scopo di escludere le patologie legate a quelle proteine.
Lo studio del gene della lamina verrà fatto su DNA leucocitario o estratto da tessuto muscolare con la collaborazione del Laboratorio di Biologia Molecolare Clinica dell'Ospedale S Raffaele di Milano. L'analisi genetica prevede l'amplificazione dei 12 esoni del gene con PCR, l'analisi degli amplificati con DHPLC, la sequenza diretta dei frammenti con pattern alterato rispetto alla norma e l'analisi dell'RNA dei pazienti con mutazioni che possono interferire con lo splicing o la stabilità del messaggero.
Trattandosi di una patologia molto rara in cui manca tuttavia ancora qualsiasi dato di tipo epidemiologico è difficile prevedere quanti casi nuovi possano essere identificati; una previsione approssimativa può comprendere 8-10 casi. Al momento abbiamo identificato due casi familiari e due casi sporadici.
I casi in cui venga identificato un deficit di lamina verranno richiamati e sottoposti a visita con una valutazione accurata della forza muscolare con esame manuale e prove funzionali ed a controlli strumentali.
L'esame manuale della forza muscolare verrà effettuato sui seguenti gruppi muscolari: orbicolari delle labbra e delle palpebre, flesso-estensori del collo, abduttori degli arti superiori con valutazione dell'abduzione a 90° e 180°, flesso-estensori del braccio e dell'avambraccio, flesso-estensori della coscia e del piede. La valutazione sarà fatta sulla base di una scala modificata Medical Research Council Scale (MRC), nel modo seguente:
0: nessuna contrazione
1: contrazione lievissima
2: movimento attivo senza forza di gravità
3: movimento attivo contro gravità
4: movimento attivo contro resistenza lieve
4/5: movimento attivo contro resistenza moderata
5: forza normale
I test funzionali comprendono la capacità di alzarsi da terra o da una sedia, di camminare, di sollevarsi sulle punte o sui tacchi, di salire le scale, di sollevare gli arti superiori sopra la testa, di sollevare un peso di 3 kg fino al livello delle spalle ed inoltre la valutazione dei movimenti fini delle dita. Sarà inoltre valutata l'eventuale presenza di contratture o blocchi osteo-articolari (polsi, gomiti, anche, ginocchia, caviglie) e di rigidità della colonna.
Quando venga identificato un paziente affetto, compresi quelli che abbiamo già identificato fino ad oggi, saranno convocati i famigliari del caso indice per valutare la presenza di fenotipi poco espressi ed essi saranno sottoposti alle stesse valutazioni cliniche ed eventualmente a determinazione della creatin chinasi e ad esami elettrofisiologici (elettromiogramma, elettroneurogramma) e ad analisi genetica.
Nei casi sottoposti a biopsia di muscolo o nervo periferico verranno tagliate nuove sezioni del campione conservato in azoto liquido alla ricerca di caratteristiche istopatologiche suggestive e con lo scopo di correlare, se possibile, il quadro clinico ed evolutivo con il quadro bioptico. Nel caso di biopsia muscolare le sezioni verranno colorate con metodi istologici ed istochimici routinari (ematossilina-eosina, tricromica di Gomori, NADH-diaforasi, LDH, SDH, citocromo c ossidasi, ATPasi miofibrillare) e saranno prese in considerazione variabilità di calibro delle fibre, presenza di necrosi, proliferazione fibro-connettivale, alterazione degli enzimi ossidativi; nel caso della biopsia di nervo periferico saranno riesaminate sezioni criostatiche colorate con ematossilina-eosina e tricromica di Gomori e sezioni semifine incluse in resina colorate con blu di toluidina e verranno prese in considerazione entità della perdita mielinica, presenza di demielinizzazione attiva o di remielinizzazione, aspetti di degenerazione simil-walleriana, alterazioni della struttura assonale, presenza di perdita assonale, presenza di rigenerazione, aumento del connettivo. Sia sulle biopsie di muscolo che di nervo verrà condotto un esame ultrastrutturale su sezioni fini colorate con acetato di uranile e citrato di piombo alla ricerca di eventuali alterazioni distintive: in particolare verranno osservate le caratteristiche dei nuclei con particolare riguardo alle alterazioni di forma e alle alterazioni della membrana.
Saranno inoltre eseguiti esami strumentali, precisamente:
1. elettrocardiogramma (ECG);
2. Holter-ECG per evidenziare eventuali alterazione del ritmo;
3. ecocardiogramma per le misurazioni cardiache;
4. eventuale studio elettrofarmacologico (SEF) con aimalina e verapamil per slatentizzare turbe della conduzione intraventricolare o intranodale;
5. risonanza magnetica muscolare per evidenziare eventuali alterazioni della componente adiposa ed interessamento selettivo di gruppi muscolari, suggerite da studi precedenti in alcune di queste forme, in analogia a quanto avviene nella lipodistrofia parziale causata appunto da difetto del medesimo gene;
6. risonanza magnetica encefalica per studiare una eventuale compartecipazione delle fibre nervose a livello del sistema nervoso centrale.
I dati clinici, strumentali e neuropatologici saranno elaborati e confrontati allo scopo di definire i criteri diagnostici, evidenziare se esista un più ampio spettro di espressioni cliniche, come già accaduto in altre malattie neuromuscolari di recente definizione e, se possibile, definire i criteri prognostici, indispensabili per la consulenza genetica, per la terapia e la prevenzione delle complicanze. Particolare attenzione sarà posta all'approccio cardiologico ed alla prevenzione della morte improvvisa con eventuale impianto di defibrillatore nei casi a rischio.