RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Patogenesi molecolare ed evoluzione clinica delle miopatie dei cingoli

Università di riferimento

Università degli Studi di PISA - NEUROSCIENZE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Gabriele Siciliano

Descrizione

1) Caratterizzazione clinica
Caratterizzazione clinica dei pazienti affetti da distrofia dei cingoli. Si prevede un campione di almeno 20 pazienti, includente pazienti, informati e consenzienti, sia già diagnosticati che eventualmente pazienti de novo, con diagnosi di sarcoglicanopatia, calpainopatia e disferlinopatia. Lo studio sarà sottoposto alla approvazione del Comitato Etico istituzionale. La valutazione clinica completa comprende un accurato esame muscolare, studio della funzionalità cardiaca e respiratoria. Per quanto riguarda l'esame muscolare verranno utilizzate la scala MRC e un multimiometro computerizzato, che permettono di valutare la forza muscolare segmentaria, e scale di valutazione funzionale su singole prestazioni motorie. Lo studio della funzione cardiaca verrà effettuato con elettrocardiogramma ed ecocardiogramma; la funzione respiratoria verrà valutata con esame spirometrico. La qualità di vita verrà inoltre valutata con scala SF-36.
L’esame di risonanza magnetica nucleare di immagine muscolare sarà condotto su sezioni standard ai cingoli e agli arti, con valutazione semiquantitativa delle alterazioni di segnale rilevabili nei diversi distretti muscolari indagati, in accordo a un protocollo di studio secondo Mercuri et al (2003), modificato.
I dati clinici saranno raccolti in un formulario da compilare per ogni paziente/famiglia sottoposto a studio.

2) Analisi del DNA:
2.1 Gli studi mutazionali sui geni dei sarcoglicani saranno condotti come riportato (Boito 2003). In sintesi, 10-50 ng di tessuto muscolare congelato saranno sottoposti ad omogeneizzazione, con successiva estrazione di RNA totale con Trizolo (Gibco, BRL) e stoccaggio in acqua RNAasi free a -80?C. Per la sintesi di cDNA circa 1-2 microg di RNA totale saranno retrotrascritti con sets di oligo-dT primers per le intere regioni codificanti dei geni dei sarcoglicani alfa, beta, gamma e delta [Boito 2003). Sarà quindi praticata SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) per lo screening di relative mutazioni; profili alterati saranno quindi direttamente sequenziati.
2.2 Gene della calpaina-3. Sarà effettuato con SSCP nei 18 più frequentemente mutati esoni del gene CAPN3, alle condiioni e usando I primers genomici come precedentemente riportato (Fanin 2003 and 2004). In casi in cui fenotipo e istopatologia muscolare sono compatibili con LGMD2A ma l’espressione proteica della calpaina è normale, l’analisi genica mutazionale sarà condotta con tests allele-specifici per le 15 mutazioni che più frequentemente ricorrono nella LGMD2A.
2.3 Gene della disferlina: saranno utilizzati sets specifici di primers per ciascuno dei 55 esoni, come descritto (Liu et al., 1998a) e sarà eseguita una reazione polimerasica a catena associata a single-strand conformational polymorphism (PCR-SSCP) a tre differenti temperature: 5, 10 and 15°C, usando un sistema di separazione GenePhor DNA e un kit GeneGel Excel 12.5/24 (Amersham Biosciences Co., Tokyo, Japan). Per rilevare con PCR da trascrittasi inversa (RT-PCR) delezioni negli esoni 25-29, saranno usati gli appositi sets di primers: Dysf6F, Dysf6R, Dysf7F e Dysf7R.

3) Studio della biopsia muscolare dei pazienti attraverso analisi istopatologiche, istoenzimatiche, immunoistochimiche e di Western blot di proteine di membrana e intrafibrali (distrofina, emerina, sarcoglicani, calpaina, disferlina, spettrina) e della matrice extracellulare (laminina). Il lavoro sperimentale inizierà con l’analisi dei livelli di espressione proteica di NF?B e di I?Ba nei campioni selezionati e nei controlli (almeno 15 soggetti non affetti da patologia muscolare, sottoposti a biopsia muscolare in corso di intervento ortopedico).
3.1 Western Blot. Campioni congelati di muscolo (20-30 mg) verranno omogeneizzati 2 volte per 15 secondi ciascuno in un omogeneizzatore Tissue-Lyzer con 19 vol buffer di trattamento contenente 0.125 mol/L Tris/HCl buffer, pH 6.4, 10% glicerolo, 4% SDS, 4 mol/L urea, 10% mercaptoetanolo, and 0.001% blu bromofenolo (pH finale del buffer di trattamento è 6.8). Inibitore aggiuntivi delle proteasi non sono necessari. I campioni verranno posti in acqua bollente per 3 minuti e centrifugati a 9500 x g per 3 minuti prima che 30µl del supernatante siano applicati in ciascun pozzetto. Un gel di poliacrilamide gel sarà messo a punto per il blotting con due fasi a gradiente: la fase inferiore sarà al 7% e quella superiore al 5.5%. I gel verranno fatti correre a 21 mA per 1 ora in un buffer contenente 1.44% glicina, 0.4% Tris e 0.2% SDS, a temperatura ambiente. Successivamente, I gel verranno blottati con una corrente di 21 mA per 1 ora. Dopo il blottaggio, I gel verranno colorati in 0.115% Coomassie blue R250 in 25% etanolo/10% acido acetico e decolorato in 10% etanolo/10% acido acetico. I siti di legame on reattivi saranno bloccati con incubazione overnight in sieroalbumina bovina (BSA) al 3% a 4° C. Il giorno dopo, verranno aggiunti gli anticorpi primari: 1) anticorpi anti-NF?B p65 (Rel A), coniglio (Rockland), corrispondente ad una regione vicina al C-terminus; 2) anti-I?Ba C-terminale specifici, coniglio (Rockland). NF?B sarà utilizzato alla diluizione di 1:4000 e I?Ba alla diluizione di 1:1000 per 2 ore atemperatura ambiente. Dopo lavaggi con buffer 4 volte per 5’min ciascuno, verrà aggiunto l’anticorpo secondario biotinilato anti-capra, diluito 1:1000, per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo lavaggi con buffer 4 volte per 5’min ciascuno, verrà aggiunto la streptavidina biotinilata HRP, diluita 1:2000, per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo lavaggi in buffer, la visualizzazione verrà effettuata con ECL: esposizione della pellicola di circa 1 minuto.
3.2 Il lavoro sperimentale proseguirà con l’analisi immunoistochimica utilizzando i suddetti anticorpi ad opportune diluizioni. Tutte le reazioni immunoistochimiche saranno effectuate su sezioni congelate, utilizzando il metodo avidina-biotina per ossidasi (Ventana Medical System). Le diluizioni messe a punto per le immunoreazioni sono 1:25 per Anti- I?Ba e 1:100 per Anti-NF?B. La controcolorazione verrà effettuata con ematossilina. I controlli negativi saranno ottenuti omettendo l’anticorpo primario. La valutazione verrà effettuata al microscopio ottico.
3.3 Fluorescein FragEL kit.
L’indice apoptotico verrà valutato con FragEL Kit (Oncogene). In questo metodo, la deoxinucleotide transferasi terminale (TdT) lega alle estremità 3’-OH libere dei frammenti di DNA generate in risposta ai segnali apoptotici e catalizza la reazione di attacco dei deossinucleotidi sia fluoresceinati che non. La fluoresceina produce un segnale intenso, che può essere riconosciuto al microscopio a fluorescenza. Il montante, fornito dal kit, rafforza il segnale fluorecente. Inoltre, l’inclusione di 4,6,-DiAmidino-2-PhenyliIndole (DAPI) consentirà la visualizzazione sia dei nuclei marcati che non ad una lunghezza d’onda di 330-380 nm con un filtro DAPI. Usando un filtro a fluorescenza (465-495 nm) un segnale verde brillante indicherà una reazione positiva. L’indice apoptotico verrà ottenuto dal confronto del numero totale dei nuclei rispetto ai nuclei apoptotici in 5HPF per campione. I campioni verranno poi classificati in base al valore di mediana.

4) Determinazione delle alterazioni di parametri funzionali motori e biochimici nello sforzo muscolare.
A tale scopo verrà effettuato test da sforzo muscolare su cicloergometro, con dosaggio venoso seriato di CPK, lattato, prodotti di ossidazione proteica e lipoperossidi, interleuchina-1, interleuchina-6, fattore di necrosi tumorale -alfa (TNF-a), E, NE e BDNF.
L'esercizio su bicicletta prevede una serie di steps della durata di 3 minuti ciascuno ad una frequenza di 60-70 giri al minuto, intervallati da 2 minuti di riposo. Il carico di lavoro viene incrementato ad ogni esercizio, secondo la capacità massima basata sull'età, il sesso, il peso e l'altezza, in ogni caso comunque fino ad un livello non superiore al 50% della potenza teorica massima. L'esercizio viene iniziato con un livello del 10% della potenza teorica massima e incrementato negli steps successivi del 10%. Tale protocollo è basato sul fatto che l'esercizio è principalmente aerobico all'inizio del test e poi diventa progressivamente anaerobico quando il carico di lavoro aumenta, dovuto al reclutamento di fibre rapide. Sia durante le condizioni basali che durante l'esercizio sono valutati i seguenti parametri: frequenza cardiaca e ventilatoria, saturazione capillare dell'O2 con emoglobina, pO2, pCO2, prelievo ematico da vena antecubitale per il dosaggio di lattato, piruvato, CPK, IL1, IL6, TNF- a.

5) Follow-up clinico-laboratoristico con monitoraggio, durante lo svolgimento della ricerca, semestrale dei parametri funzionali motori, e ogni dodici mesi di quelli di immagine di risonanza magnetica nucleare e dello sforzo muscolare, definizione del relativo significato prognostico e peso sulle scale di valutazione funzionale e di qualità di vita.

6) Analisi statistica dei dati
- Confronto dei dati bioptici muscolari tra pazienti e controlli con test T Student per dati non appaiati.
- Analisi di correlazione genotipo-fenotipo con test di Spearman e test di regressione multipla tra dati clinici, bioptici e dell’esercizio.
- Confronto longitudinale nei pazienti con test T Student per dati appaiati dei dati clinici, di immagine di risonanza magnetica nucleare e dello sforzo muscolare.
- Caratterizzazione clinica dei pazienti ed identificazione di eventuali fenotipi specifici.