RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Tumori Neuroendocrini Polmonari (Carcinoidi) e Gastro-Entero-Pancreatici (GEP): Caratterizzazione clinica, immunofenotipica e molecolare nella definizione della prognosi e dell'iter terapeutico.

Università di riferimento

Università degli Studi di FERRARA - SCIENZE BIO-MEDICHE E TERAPIE AVANZATE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Marta Bondanelli

Descrizione

OBIETTIVI SCIENTIFICI
Lo scopo del nostro studio è quello di valutare l’influenza di SRIF e di suoi analoghi selettivi per i diversi sottotipi recettoriali sulla proliferazione e sulla secrezione cellulare nei tumori neuroendocrini di origine bronchiale o gastro-intestinale, nel feocromocitoma e nell’MTC.
a) Investigare l’espressione di SRIF e di SSTR nelle cellule neuroendocrine neoplastiche tramite PCR qualitativa e quantitativa.
b) Esplorare gli effetti di SRIF e di agonisti selettivi per SSTR sulla proliferazione e sull’attività secretoria delle cellule neuroendocrine neoplastiche in colture primarie ed in linee cellulari
c) Ottenere un archivio di tessuti raccolti a fresco da pazienti sottoposti a chirurgia per neoplasie neuroendocrine di origine bronchiale o gastro-intestinale, surrenectomia per feocromocitoma e tiroidectomia totale per MTC o iperplasia delle cellule C (CCH).

RISULTATI ATTESI
1. Determinare l’espressione quantitativa degli SSTR neoplasie neuroendocrine umane di origine bronchiale o gastro-intestinale, nel feocromocitoma e nell’MTC
2. Determinare quale agonista selettivo per SSTR possa principalmente modulare le funzioni differenziate delle cellule neuroendocrine e se l’attivazione di uno o più SSTR possa ottenere un miglior controllo della secrezione/produzione ormonale e della proliferazione cellulare.
I risultati di questi studi, confrontati con quelli derivanti dall’analisi clinica, biochimica e dalle indagini diagnostiche scintigrafiche tese a valutare la recettorialità somatostatinergica delle neoplasie neuroendocrine, potranno formare le basi razionali per individuare indici diagnostici e prognostici e favorire quindi un nuovo approccio terapeutico delle neoplasie neuroendocrine.


DESCRIZIONE DELLA RICERCA
Lo scopo del Progetto di Ricerca è di indagare l’espressione di SRIF ed SSTR in neoplasie neuroendocrine, inclusi il feocromocitoma e l’MTC, tramite PCR quantitativa e l’immunoistochimica. Verranno inoltre valutati gli effetti di SRIF e di agonisti selettivi per SSTR sulla differenziazione e proliferazione delle cellule neuroendocrine (linea cellulare di MTC, TT, e colture primarie di neoplasie neuroendocrine GEP o bronchiali, feocromocitoma ed MTC).
Dai pezzi operatori verranno subito preparate colture primarie dai tumori neuroendocrini, sulle quali verranno testati gli analoghi selettivi di SRIF. Inoltre, una porzione del tessuto verrà immediatamente congelata per eseguire l’estrazione dell’RNA e l’analisi di RT-PCR quantitativa.
Al fine di determinare quale SSTR moduli principalmente le funzioni differenziate delle cellule neoplastiche neuroendocrine, le colture primarie provenienti dai vari tipi di neoplasia e le cellule TT saranno trattate con concentrazioni crescenti degli appropriati analoghi di SRIF, raccogliendo il surnatante per i dosaggi ormonali tramite RIA o ELISA. Inoltre saranno raccolte le cellule per la valutazione del contenuto in proteine o RNA, in particolare per misurare il contenuto intracellulare di ormoni peptidici tramite Western blot o di mRNA per tali ormoni tramite Northern blot e/o PCR quantitativa.
Al fine di valutare gli effetti di SRIF e degli agonisti selettivi SSTR sulla proliferazione, le cellule TT e le colture primarie verranno trattate con concentrazioni crescenti degli appropriati analoghi di SRIF e verrà poi valutato il numero di cellule vive con metodi colorimetrici o tramite la misura della captazione di timidina triziata. Verrà inoltre valutata la progressione attraverso il ciclo cellulare tramite FACS analisi (citofluorimetria a flusso).

METODI
Colture primarie
La raccolta e l’uso dei campioni di tessuto sarà in accordo con le linee guida del Comitato Etico locale per la ricerca scientifica. I campioni verranno prelevati in condizioni sterili al momento dell’intervento ed un frammento verrà congelato immediatamente in azoto liquido e conservato a -80° C fino al momento dell’estrazione dell’RNA ed all’esecuzione della reazione di retrotrascrizione (RT). Per valutare gli effetti di SRIF e dei suoi analoghi sulle colture primarie, verranno allestite colture monostrato di cellule tumorali da una porzione di tessuto fresco prelevato in corso di intervento per asportazione della massa da pazienti afferenti alla nostra Unità o ad una delle altre Unità partecipanti al progetto. Il tessuto verrà dissociato enzimaticamente usando collagenase e tripsina. Le sospensioni cellulari verranno filtrate attraverso un doppio strato di garza e lavate due volte con DMEM senza siero. Le cellule verranno poi risospese nel mezzo di coltura con FBS al 10% ed antibiotici, seminate in piastre da 96 pozzetti (~2 x 104 cellule/pozzetto) ed incubate a 37°C in 5% CO2 e 95% aria. Dopo 24 ore, le cellule verranno incubate durante la notte in mezzo di coltura senza siero. Il giorno dopo, le cellule verranno trattate per 6 ore con concentrazioni crescenti di SRIF e ciascun analogo. Il surnatante verrà raccolto e conservato a –20°C per i dosaggi ormonali, rinnovando i trattamenti per altre 48 ore per gli esperimenti di vitalità cellulare.

RT-PCR
L’analisi per RT-PCR verrà eseguita come precedentemente descritto (1). Per confermare la corretta identità dei prodotti di RT-PCR, la loro specificità verrà verificata tramite analisi di restrizione e sequenziamento diretto.

Real-time PCR
Per eseguire una PCR quantitativa (QPCR) verranno utilizzati primers e sonde disegnate con il programma Primer Express Software (PE Applied Biosystems), basandosi sulle sequenze disponibili nella Gene Bank. Verrà utilizzata una sonda TaqMan (PE Applied Biosystems) marcata con un fluoroforo (6-carbossi-fluoresceina, FAM) ed un quencher (6-carbossi-tetrametilrodamina, TAMRA). Verranno utilizzati i Pre-Developed TaqMan Assay Reagents per il 18S rRNA umano (20x) per l’amplificazione del gene housekeeping (PE Applied Biosystem). La reazione di QPCR verrà eseguita in triplicato in un volume di reazione pari a 50 ?l, contenente la TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Applied Biosystems) e concentrazioni appropriate di primers forward e riverse. Due ?l di cDNA (corrispondenti a 100 ng di RNA totale retro-trascritto) e 2 ?l di RT- saranno amplificati secondo un profilo termico appropriato. Tutte le reazioni di QPCR saranno eseguite, registrate ed analizzate utilizzando lo strumento ABI 7700 Prism Sequence Detection System (PE Applied Biosystems). La quantificazione assoluta del numero di copie di mRNA nel campione verrà eseguita seguendo gli Standard Curve Methods (Separate Tubes) (User Bulletin #2 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System, PE Applied Biosystems). Diluizioni seriali dell’oligonucleotide sense a singolo strand (da 109 a 102 molecole) verranno eseguite in triplicato. Il logaritmo del numero di copie nei campioni verrà calcolato dalla retta di regressione secondo l’equazione logN=(Ct-q)/m, dove Ct è il ciclo soglia, q è l’intercetta sull’asse delle ordinate e m è la pendenza della curva standard. Tutti i campioni verranno analizzati in triplicato (100 ng di RNA totale retro-trascritto per pozzetto) e ripetuto almeno due volte. Per ogni campione verrà caricato anche un punto di 18S rRNA per valutare l’efficienza di retrotrascrizione sullo stesso cDNA e con le stesse condizioni di PCR. I controlli negativi “No Template Control” e RT- verranno utilizzati in ogni esperimento.

Northern blot
L’analisi per Northern blot sarà eseguita con RNA totale estratto dalle cellule e dai tessuti con Trizol (Invitrogen), separato per elettroforesi su un gel denaturante e trasferito su membrana appropriata (Zeta-ProbeR GT membrane, Bio-Rad, Milano, Italy). La marcatura della sonda sarà eseguita usando ?32P-dCTP (6000 Ci/mmol) ed il kit per la marcatura random. La preibridazione e l’ibridazione saranno eseguite a 65°C con l’appropriata soluzione di ibridazione. I segnali autoradiografici verranno analizzati con lo strumento Personal-FX (Bio-Rad) e la quantificazione delle bande verrà svolta tramite il programma Quantity-One (Bio-Rad). I frammenti complementari alle sonde verranno ottenuti per RT-PCR da RNA totale da cellule TT. La reazione di RT-PCR verrà eseguita, utilizzando la macchina per PRC GeneAmp PCR System (Applera, Monza, Italy). I prodotti di PCR verranno analizzati su gel di agarosio, visualizzati tramite colorazione con etidio bromuro e purificati dal gel. Prima di utilizzarli per la costruzione delle sonde, la specificità di ciascun prodotto di PCR verrà verificata tramite analisi di restrizione specifica e sequenziamento diretto per confermare ulteriormente l’identità degli ampliconi.

Western blot
Gli estratti cellulari verranno preparati lisando le cellule con appropriati tamponi di lisi e le proteine verranno risolte su gel denaturanti di poliacrilamide al 8 - 12,5 % e quindi trasferite per elettroforesi su membrane di nitrocellulosa. I blot verranno quindi incubati con gli anticorpi specifici, e la rilevazione delle bande proteiche specifiche avverrà mediante chemiluminescenza.

Proliferazione cellulare
Sintesi di DNA: La sintesi di DNA in corso dei vari trattamenti sarà valutata misurando l’incorporazione di [3H]timidina ([3H]thy). Le cellule verranno esposte a varie concentrazioni dei composti di interesse per 24 e 48 ore in presenza di [3H]thy. Dopo l’incubazione, la radioattività associata alle cellule verrà valutata tramite uno spettromentro a scintillazione.
Valutazione della vitalità cellulare: Variazioni del numero di cellule dovute ai vari trattamenti verranno valutate con il kit Cell Titer 96? Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Milano, Italy). Dopo l’incubazione, la soluzione di rilevazione verrà aggiunta e verrà valutata l’assorbanza a 490 nm mediante un lettore di piastra ELISA.

In collaborazione con l’Unità di Genova verrà effettuata inoltre una valutazione immunistochimica per verificare l’espressione delle proteine recettoriali per la somatostatina. Ove possibile il tessuto neoplastico verrà reso disponibile alle altre unità per ulteriori indagini e sui relativi meccanismi di trasduzione del segnale, in modo da ottenere un quadro più completo delle caratteristiche biologiche della singola neoplasia.

Correlazioni in vitro – in vivo
I risultati delle analisi molecolari verranno correlati con le caratteristiche del paziente (età, sesso, familiarità, stadiazione della neoplasia) e le caratteristiche della neoplasia (dimensioni, invasività, eventuale recidiva e/o metastasi a distanza, profilo immuno-istopatologico, indici di proliferazione, fattori molecolari prognostici)

I risultati di tali correlazioni potranno permettere di individuare quali pazienti possano giovare di un trattamento medico della neoplasia, della recidiva o delle metastasi con analoghi di SRIF. Tali informazioni potranno essere utili anche per selezionare i pazienti che possano eventualmente giovare di una terapia radiometabolica con analoghi di SRIF, con prospettiva di un futuro utilizzo di molecole selettive per gli SSTR maggiormente coinvolti. Inoltre, le informazioni fornite dalla nostra esperienza in vitro (integrate con quelle delle altre Unità) potranno essere utili per una eventuale applicazione clinica futura di una terapia genica per le neoplasie neuroendocrine.

Breve descrizione degli strumenti disponibili per la ricerca
Il Laboratorio della Sezione di Endocrinologia è fornito di 5 freezers (-20°C and –80°C), 3 frigoriferi (4°C), un contenitore per la criopreservazione di linee cellulari, un microdismembratore di tessuti, 3 criocentrifughe, 2 incubatori a CO2 per colture cellulari, una cappa per colture cellulari, un microscopio, un microscopio a fluorescenza, 4 termociclatori per PCR, un lettore ELISA, un gamma-counter, un beta-counter, 3 cappe chimiche, apparati per elettroforesi orizzontale e verticale con relativi alimentatori, un sistema computerizzato per l’analisi di substrati fluorescenti, un fornetto per ibridazione, una sviluppatrice, un sistema per l’analisi HPLC, uno spettrofotometro, un’autoclave, 2 fornetti termostatici.