RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Somatostatina e peptidi correlati: distribuzione, effetti biologici e caratterizzazione di modelli transgenici

Università di riferimento

Università degli Studi di TORINO - MORFOFISIOLOGIA VETERINARIA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Adalberto Merighi

Descrizione

Razionale dello studio
Molte forme di dolore infiammatorio (ad es. artrite) o cronico sono controllate in maniera insufficiente dalle terapie attualmente disponibili. Pertanto lo sviluppo di trattamenti più efficaci e meno pericolosi è altamente auspicabile. A tale scopo, la ricerca neurobiologica di base potrebbe fornire informazioni sufficienti per comprendere i circuiti neuronali e i meccanismi che controllano la trasmissione inibitoria nelle vie nocicettive. L’uso clinico di SOM è limitato dalla sua rapida degradazione in seguito a somministrazione per via sistemica e dalla neurotossicità, quando il peptide viene applicato direttamente a livello del midollo spinale, per via intratecale, in singole somministrazioni ad alto dosaggio [21,23,24]. Per tali ragioni, nella pratica clinica si preferisce l’utilizzo di OCT. Questo octapeptide agisce come analgesico per via intratecale, intracerebroventricolare, epidurale o sistemica in pazienti con dolore cronico conseguente a patologie oncologiche, dolore intenso intrattabile, dolore post-operatorio, dolore osseo conseguente a osteoartriti o artriti reumatoidi, dolore viscerale e emicrania. Tuttavia, i trattamenti prolungati con OCT inducono assuefazione e, inoltre, la soluzione acida necessaria per i trattamenti con OCT danneggia rapidamente le pompe da infusione. Recentemente è stato descritto un meccanismo completamente nuovo in grado di promuovere il rilascio endogeno di SOM [42]. In ratti adulti è stato osservato che, in seguito a somministrazioni prolungate di GDNF per via intratecale, aumenta sia il numero di neuroni di tipo B dei gangli spinali che esprimono SOM, sia il rilascio di SOM nel corno dorsale dai terminali centrali dei neuroni sensitivi [7]. Oltre all’effetto sull’espressione della SOM (che ricorda l’effetto di NGF sulla SP), è stato osservato che somministrazioni di GDNF in preparazioni in vitro di corno dorsale isolato sono in grado di produrre un rapido rilascio di SOM dai neuroni sensitivi [8] e che il GDNF esogeno esercita, in modelli animali, effetti anti-infiammatori e anti-iperalgesici sensibili all’applicazione di antagonisti della SOM.
La possibilità di studiare circuiti neuronali attivati da SOM e/o da OCT in vitro potrebbe essere assai vantaggiosa. Abbiamo recentemente sviluppato nel nostro laboratorio una preparazione in acuto di fettine di midollo spinale che ci ha consentito di studiare gli effetti inibitori della SP nei neuroni della lamina II [43] e tale approccio potrebbe fornire un ambiente controllato sul quale effettuare con facilità studi fisiologici e farmacologici del sistema SOM/OCT. Inoltre, la scelta del topo come animale da esperimento può consentire di lavorare anche su modelli transgenici.
Le osservazioni precedentemente riportate relative all’interazione tra SOM e grelina, nonché gli effetti di quest’ultima nella regolazione della trasmissione GABAergica a livello encefalico, suggeriscono che, molto probabilmente, questi due modulatori interagiscano anche nell’elaborazione dell’informazione nocicettiva a livello del midollo spinale. Una serie di risultati preliminari ottenuti da esperimenti eseguiti allo scopo di valutare l’espressione di grelina e del suo recettore e gli effetti dell’applicazione esogena in fettine acute di midollo spinale indicano che anche questo peptide giochi un ruolo nella regolazione della soglia di eccitabilità dei nocicettori spinali (Fig. 1-4). Inoltre, il fatto che CST-14 leghi gli stessi recettori di SOM suggerisce la possibilità che anche questo peptide possa intervenire nella regolazione della neurotrasmissione dolorifica a livello spinale.



Fig 1: Effetti dell’attivazione di GHS-R sugli EPSC in neuroni di lamina II. (A) sinistra: dati raccolti da 10 neuroni di lamina II in condizioni di controllo (CTR) e in presenza di esarellina (Hexa, 100 nM). La frequenza media è 1.2 ± 0.3 Hz nel controllo e 1.3 ± 0.4 Hz in presenza di esarellina (n=10, p>0.05). Destra: attività spontanea in controllo (traccia in alto) e dopo esarellina (traccia in basso). Inserto: il disegno rappresenta la zona del corno dorsale in cui sono stati registrati i neuroni. (B) dati raccolti da 10 neuroni rappresentanti la frequenza e l’ampiezza media degli EPSC registrati in condizioni di controllo e in presenza di grelina (Ghre, 100 nM). (C) sinistra: sEPSC registrati dal solo neurone di lamina II che ha risposto a grelina. Si noti l’intenso aumento della frequenza degli sEPSC (da 2.7 Hz a 13.9 Hz). Destra: istogrammi cumulativi della distribuzione della frequenza e dell’ampiezza degli sEPSC nel controllo e in presenza di grelina (stesso neurone).


Fig 2: Morfologia dei neuroni grelina-responsivi nel midollo spinale e localizzazione immunocitochimica di grelina e del suo recettore. A-B: morfologia complessiva di due neuroni grelina-responsivi in seguito a riempimento intracellulare con LY (A) o biocitina (B) durante la registrazione. I traccianti sono stati aggiunti alla soluzione intracellulare e dializzati nel citosol. Alla fine della registrazione le fettine sono state fissate e osservate con un microscopio a fluorescenza (A) o processate per la visualizzazione al microscopio ottico della biocitina (B). In entrambi i casi i neuroni responsivi, sono risultati essere multipolari, con pochi dendriti principali, apparentemente privi di spine. I corpi cellulari si presentavano fusiformi (A) o sferoidali (B). Si confronti la morfologia della cellula in A con quella del neurone marcato per GHS-R in F.
C-E: visualizzazione immunocitochimica del peptide grelina nei gangli spinali (C) e nel midollo spinale (D-E). L’immunocitochimica è stata effettuata utilizzando la tecnica di intensificazione con TSA e un anticorpo primario diretto contro il frammento 13-28 della grelina umana diluito 1:15000 (clone TUR2, gentile omaggio del Prof. G. Rindi, Univeristà di Parma). Nei gangli spinali (C) l’immunoreattività è stata osservata in un limitato numero di cellule medio-grandi e in alcuni dei loro prolungamenti. Nel midollo spinale (D-E) l’immunoreattività è stata osservata nelle lamine profonde del corno dorsale (IV-VI), nel corno ventrale e nella regione circostante il canale centrale. L’immagine in E mostra la distribuzione granulare della marcatura in neuroni positivi del corno ventrale. L’asterisco in D indica l’area in cui sono state più spesso registrate le cellule resposive (si vedano i risultati). Questa area corrisponde alla regione in cui sono stati osservati sia i neuroni responsivi riempiti con il tracciante sia i corpi cellulari GHS-R- immunoreattivi. F: Localizzazione immunocitochimica del GHS-R nel midollo spinale. La marcatura immunocitochimica è stata ottenuta utilizzando con un anticorpo primario diretto contro l’estremità C terminale del GHS-R di ratto (Alpha Diagnostic International, USA) diluito 1:500 su fette flottanti tagliate al vibratomo.
Abbreviazioni: CC = canale centrale; DH = corno dorsale; DRG = ganglio spinale; Ghre = peptide grelina; GHS-R = recettore grelina; VH = corno ventrale; WM = sostanza bianca. I numeri romani indicano le lamine del corno dorsale.



Obiettivi specifici
Questo progetto ha durata biennale e si propone essenzialmente di fornire una risposta alle seguenti domande:
- SOM/OCT hanno un ruolo nella trasmissione inibitoria in lamina II, simile a quanto precedentemente osservato per SP?
- esiste una relazione funzionale tra SOM, grelina e CST-14 nella neurotrasmissione sensitiva a livello del midollo spinale?
- In caso positivo, gli effetti di grelina sulla neurotrasmissione inibitoria che abbiamo osservato nei nostri studi preliminari possono essere antagonizzati da SOM/OCT?
- esiste una colocalizzazione CST-14/GABA nei neuroni delle corna dorsali del midollo spinale?
- se CST-14 è espressa e agisce a livello spinale, il suo ruolo è di tipo eccitatorio o inibitorio sulla trasmissione dolorifica?
- è possibile stimolare un rilascio endogeno di SOM somministrando GDNF su fettine di midollo spinale e/o su colture organotipiche?
- in caso affermativo, attraverso quale meccanismo GDNF evocherebbe il rilascio di SOM da fonti intrinseche al midollo spinale?
- la stimolazione con GDNF di fettine/colture influenza le risposte elettrofisiologiche alla grelina e/o a CST-14 dei neuroni del corno dorsale?
Si ritiene che comprendere i meccanismi dell’interazione SOM/grelina/CST-14 nel sistema sensitivo del midollo spinale possa fornire dati fondamentali per la comprensione del ruolo di queste molecole neuroattive nell’elaborazione dell’informazione nocicettiva sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

Fasi del progetto
Nel primo anno del progetto verranno utilizzati topi di tipo selvatico (Charles River) per determinare la localizzazione di SOM, grelina e CST-14 e le risposte elettrofisiologiche alla applicazione di tali molecole su fettine in acuto di midollo spinale.
Verranno inoltre messe a punto colture organotipiche di midollo spinale e/o co-colture midollo spinale/gangli spinali per valutare gli effetti di trattamenti di media/lunga durata. Abbiamo già ottenuto registrazioni elettrofisiologiche da colture di midollo spinale mantenute in vitro per oltre 20 giorni che dimostrano l’esistenza di una normale attività neuronale spontanea in tali condizioni sperimentali.
Nel secondo anno del progetto verranno effettuati esperimenti su animali transgenici con delezione del gene della grelina o del gene cst. Lo studio di questi animali consentirà di determinare le conseguenze anatomiche della delezione genica nelle corna dorsali del midollo spinale nonché le alterazioni funzionali sulla trasmissione GABAergica inibitoria. Se possibile verranno infine eseguiti esperimenti su topi con knock out condizionale del gene cst in dipendenza della coespressione di cre ricombinasi. Questi mutanti consentiranno di analizzare gli effetti dell’ablazione genica di cst su colture organotipiche.

Metodi
Preparazione delle fettine: le fettine di midollo spinale saranno ottenute da topi di età compresa fra 8 e 21 giorni (P8-P21). In seguito ad anestesia profonda con barbiturici, il midollo spinale lombare sarà rimosso mediante laminectomia e posto in liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) freddo (in mM: Colina-Cl 110; KCl 2.5; CaCl2, 0.5; MgCl2 7; NaH2PO4 1.2; NaHCO3; 25, acido ascorbico 1.3; Na-Piruvato 2.4; glucosio 20). Il midollo spinale sarà poi tagliato in pezzi di circa 2 mm e attaccato a un piccolo supporto in Sylgard. Le fettine, trasversali (150-250 µm), saranno ottenute con un vibratomo, come precedentemente descritto [44]. Subito dopo il taglio, le fette saranno poste a ricostituirsi per 45 minuti a 37 °C in ACSF.
Patch clamp: le registrazioni saranno effettuate nella configurazione “whole-cell”. Le cellule saranno individuate con un microscopio Zeiss Axioskop 1, dotato di un sistema con mezzo di contrasto ottico a infrarossi (Luigs & Neumann) e con un obiettivo 63X a immersione elettricamente isolato. Gli elettrodi saranno tirati con un puller verticale (Narishige PC10). Le registrazioni saranno ottenute con un amplificatore per patch clamp (Axon Instruments) in modalità “current-clamp” e “voltage clamp”, digitalizzate con l’interfaccia Digidata 1200A e analizzate con il software PCLAMP8 (Axon Instruments).
Immunocitochimica: saranno impiegate tecniche di immunocitochimica a livello di microscopia ottica (con metodo ABC su criostato, su paraffina o su sezioni al vibratomo) e elettronica tramite procedure post-inclusione di marcatura con particelle d’oro effettuate direttamente su retino. Queste tecniche saranno volte alla caratterizzazione neurochimica dei contatti sinaptici tra FAP e i neuroni registrati elettrofisiologicamente. In questo studio verranno utilizzati anticorpi specifici contro SOM, SP, CGRP, GABA, grelina, GHS-R, CST-14. Questi anticorpi sono stati ampiamente caratterizzati in studi precedenti.
Studi sulla connettività neuronale: le cellule di interesse saranno riempite con lucifer yellow (LY). In seguito a riempimento con il tracciante, le fettine saranno fissate in 4% paraformaldeide + 0.5% glutaraldeide in tampone fosfato Sörensen. Basandosi su un protocollo precedentemente descritto [45], la 3,3' diaminobenzidina (DAB) sarà fotoconvertita in un precipitato opaco a livello dei siti di fluorescenza del LY. Le fettine saranno quindi processate per la microscopia elettronica e incluse. Le cellule riempite con il tracciante saranno disegnate con un sistema grafico digitale, prima di essere re-incluse e tagliate.
RT-PCR: l’RNA totale sarà estratto con RNAWiz (Ambion, USA). Brevemente, 1 ml di RNAWiz sarà aggiunto a 100 mg di tessuto congelato e il campione omogeneizzato sarà tenuto in condizioni sterili. I campioni saranno in seguito trattati secondo le istruzioni del produttore. La trascrizione inversa sarà effettuata con un apposito kit (Ready-To-Go First strand; Amersham Pharmacia Biotech, Sweden) secondo le istruzione del produttore. 1 mg di RNA totale sarà usato per la trascrizione inversa. Il DNA complementare così ottenuto sarà suddiviso in aliquote di 3 ml e utilizzato per la successive amplificazione mediante PCR addizionandolo al reagente Ready-To-Go PCR (Amersham Pharmacia Biotech) in modo da raggiungere il volume finale di 25 ml. L’amplificazione sarà effettuata secondo quanto precedentemente riportato [46]. I prodotti della PCR saranno visualizzati in bromuro di etidio in seguito a elettroforesi su gel di agarosio al 2%.