RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Somatostatina e peptidi correlati: distribuzione, effetti biologici e caratterizzazione di modelli transgenici

Università di riferimento

Università degli Studi di TORINO - SCIENZE CLINICHE E BIOLOGICHE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Mauro Giulio Papotti

Descrizione

FASE 1 = Distribuzione di cortistatina e, per confronto, di somatostatina (e dei loro recettori) nel sistema nervoso, ghiandole endocrine e tessuti e organi periferici di: 1A) tessuti umani fetali, 1B) tessuti umani adulti, 1C) tessuti di topi transgenici null per somatostatina e/o cortistatina. 1D) Valutazione espressione in tumori di origine nervosa e neuroendocrini.

PREMESSA METODOLOGICA
In questa fase, il progetto è interamente dedicato alla costruzione di una mappa accurata di espressione di ligandi (somatostatina e cortistatina) e dei loro recettori (recettori della somatostatina tipo 1-5, GHS-R, MRGX2) in organi e tessuti umani ed animali. L’approccio metodologico è uniforme e prevede in prima istanza l’analisi morfologica di organi e tessuti con indagine istopatologica standard (utile soprattutto nei modelli animali transgenici, di cui manca un profilo delle alterazioni morfologiche), associata ad indagine immunoistochimica con anticorpi specifici (disponibili in commercio) su campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina. La procedura per rivelare antigeni cellulari è standardizzata e, a partire da anticorpi mono o policlonali già adeguatamente testati nel nostro laboratorio, utilizza sistemi di rivelazione altamente sensibili e privi di legami con biotina, onde escludere possibili aspecificità dovute alla presenza di biotina endogena in vari tessuti. La procedura è automatizzata (Autostainer, DakoCyomation, Danimarca). Doppie colorazioni per co-localizzare differenti ormoni, ormoni e recettori, o antigeni diversi nella stessa sezione, saranno effettuate con sistema analogo di immunoperossidasi o con immunofluorescenza con anticorpi secondari marcati con fluorocromi.
In tutti i casi in cui verrà identificata una marcatura da parte degli ormoni o recettori indagati, sarà valutata parallelamente l’espressione del corrispondente mRNA specifico. Ciò avverrà a mezzo di sistemi di localizzazione dell’mRNA quali ibridizzazione in situ, per poter definire con certezza non solo la presenza dell’mRNA specifico, ma identificare il sottotipo cellulare che esprime il trascritto in esame. In alternativa, lo stesso mRNA potrà venire studiato con sistemi di amplificazione, quali RealTime PCR, per ottenere dati di tipo quantitativo, utilizzando campioni di tessuto crio-preservato corrispondenti ai campioni fissati in formalina ed utilizzati per l’indagine più sopra descritta. Le procedure di estrazione di acidi nucleici e PCR o ibridizzazione in situ seguiranno i protocolli standard disponibili in letteratura, in parte pubblicati dal nostro gruppo, per le diverse sonde molecolari.
In particolare, la presenza di recettori per somatostatina e cortistatina sarà saggiata con anticorpi specifici e tecniche di rivelazione del mRNA specifico, come sopra descritto. Saranno valutati i recettori per somatostatina tipo 1-5, il recettore per la ghrelina (precedentemente indicato come GHSR-1a e oggi GRLN) e il recettore MrgX2 che nell’uomo lega con elevata specificità la cortistatina e anche la adrenomedullina. Inoltre, su sezioni criostatiche sarà saggiato in modo diretto il legame di cortistatina o somatostatina marcata, in analogia con una procedura sviluppata nel nostro laboratorio per l’ormone ghrelina (Volante M et al, Am J Pathol 2003). Si tratta di una tecnica di legame in situ, simile all’ autoradiografia ma che non prevede l’utilizzo di reagenti radioattivi, che permette di localizzare a livello tessutale i siti leganti un determinato peptide, e di riconoscerne le specifiche cellule bersaglio. In particolare, secondo la metodica sopra citata, la ghrelina è stata coniugata a biotina, ed il complesso così formato è risultato in grado di legarsi alle cellule che esprimono il sito di legame per questo ormone ed essere evidenziato mediante una convenzionale reazione con streptavidina e perossidasi.
Una ampia banca di tessuti normali e neoplastici conservati a -80°C è disponibile presso il nostro laboratorio, e la raccolta di campioni è in continuo aggiornamento secondo modalità di raccolta ottimizzate per l’allestimento di campioni idonei per biologia molecolare e per colture in vitro. Tutti i campioni umani utilizzati saranno impiegati solo dopo de-identificazione e codifica, affinché ogni frammento o sezione istologica non possa venire ricondotta al soggetto da cui questo è stato ottenuto, nel rispetto della normativa sulla privacy. La de-identificazione e codifica dei campioni avviene da parte di personale non direttamente coinvolto nel progetto di ricerca e segue le norme suggerite al riguardo (si veda: Merz JF, et al. J Investig Med 1997; 45: 252-7).
I modelli di animali transgenici saranno forniti dal laboratorio del prof Luis de Lecea dell’Università di Stanford, USA, con il quale è in atto un programma di collaborazione, ed i tessuti relativi verranno trattati ed allestiti analogamente ai tessuti umani.

1A) Poiché non esistono dati disponibili in letteratura sulla distribuzione della espressione di cortistatina in tessuti umani fetali e sono scarsi quelli inerenti al profilo di espressione della somatostatina, il presente progetto si propone di analizzare campioni di tessuti fetali in varie fasi dello sviluppo, in parallelo con i tessuti umani adulti. Al riguardo verranno raccolti campioni di sistema nervoso centrale e periferico, ghiandole endocrine e organi viscerali di feti in diverse epoche gestazionali, giunti all’esame istologico o autoptico per aborti spontanei o per interruzioni volontarie di gravidanza. Tale materiale verrà in parte congelato, in parte trattato con fissazione in formalina ed inclusione in paraffina, analogamente a quanto descritto per i tessuti normali e neoplastici dell’adulto.

1B) I dati preliminari in una serie di tessuti normali e patologici periferici, discussi nel precedente capitolo introduttivo, indicano che l’espressione di cortistatina è ristretta ad alcuni organi (ad esempio paratiroidi, tratto gastroenterico e pancreas). Sarà pertanto completata la mappa di espressione di cortistatina in tessuti normali (da campioni operatori o autoptici) per meglio definire, al di fuori della corteccia cerebrale, i tessuti periferici sorgenti di cortistatina, anche in parallelo all’espressione di somatostatina mediante esperimenti di co-localizzazione in fluorescenza.
In particolare, saranno studiati tessuti nervosi periferici (nervi e gangli), tessuti di origine mesodermica quali tessuto connettivo di differente tipo istologico, cellule del sistema immunitario e macrofagi, ghiandole endocrine e tutti i tessuti epiteliali (squamoso, uroteliale e ghiandolare di varie sedi). L’ampio spettro di tessuti indagati rispecchia le sempre più larghe evidenze di attività “endocrina/paracrina” in senso lato di cellule quali linfociti, cellule endoteliali, cellule epiteliali specializzate ed altre. Colorazioni parallele con cromogranina A saranno eseguite per confermare il fenotipo neuroendocrino in cellule eventualmente dimostrate produrre cortistatina e/o somatostatina. Le cellule del sistema immunitario e linfatico, già note esprimere cortistatina (come in precedenza accennato), saranno studiate con anticorpi specifici (ad esempio, CD3, 45, 20, 68, 10, 34) per tipizzare le varie sottopopolazioni esprimenti cortistatina e eventualmente somatostatina. L’indagine sarà estesa non solo a linfonodi ma anche ad altri organi effettori della risposta immunitaria quali tonsilla, milza, timo e tessuto linfatico associato alle mucose (MALT).

1C) Per consolidare i dati sulla localizzazione in tessuti umani di cortistatina e somatostatina, verrà analizzata la distribuzione anatomica di questi ormoni in tessuti periferici di animali transgenici null per entrambi gli ormoni, singolarmente o in doppio knock-out. Studi pilota su tali animali hanno mostrato la apparente mancanza di alterazioni funzionali che interferiscano con la crescita corporea. Non esistono però a tutt’oggi dati di alterata espressione ormonale e/o recettoriale a livello tissutale, anche in ordine alla co-espressione di cortistatina e somatostatina con ormoni propri di varie ghiandole endocrine, con il possibile riconoscimento di utili basi per correlati funzionali. Tale fase del progetto è legata alla collaborazione con il Prof Luis de Lecea dell’Univerità di Stanford (USA) per lo studio di modelli transgenici già prodotti nei laboratori di Stanford. In particolare, verrà eseguita l’analisi istopatologica su tutti i tessuti centrali e periferici di tali animali dopo fissazione in formalina tamponata dei vari organi e tessuti. Saranno allestiti preparati istologici con metodica convenzionale di tali animali transgenici e per confronto di animali sani, comprendente sezioni di corteccia cerebrale, cerebellare, nuclei della base, ippocampo, ipotalamo, mesencefalo. Inoltre le ghiandole endocrine (ipofisi, tiroide, paratiroide, pancreas, surrene e gonadi) saranno esaminate morfologicamente per evidenziate anomalie di sviluppo, unitamente a tutti gli altri organi e apparati periferici. Di ogni tessuto saranno allestite in parallelo colorazioni immunoistochimiche per i vari ormoni, ed eventualmente per i relativi recettori, su sezioni seriate. Inoltre, in base alla disponibilità del materiale, campioni congelati verranno conservati per l’esecuzione di indagini di espressione degli specifici mRNA mediante tecniche di biologia molecolare. La valutazione combinata di tecniche di biologia molecolare su estratto di tessuto con quelle di localizzazione (immunoistochimica, ibridazione in situ) appare cruciale per definire le sorgenti di produzione di detti ormoni, oltre che di ormoni propri di varie ghiandole endocrine.

1D) Dalla valutazione di cui ai punti 1A e B, emergerà un profilo di distribuzione delle cellule producenti somatostatina e cortistatina, da cui deriverà una successiva indagine su corrispondenti tessuti neoplastici. Ad esempio, l’informazione preliminare che cortistatina è espressa in cellule paratiroidee implica la valutazione di una serie di lesioni umane delle ghiandole paratiroidi insorte nel contesto di iperparatirodismo primitivo o secondario. Al riguardo è già disponibile presso il nostro laboratorio una casistica di 28 carcinomi, 50 adenomi e numerose forme iperplastiche paratiroidee, già classificate in base alla malattia di base e alla familiarità, recentemente oggetto di uno studio rivolto alla identificazione di marcatori di malignità (Saggiorato et al, Am J Clin Pathol, 2006; in stampa). La base di materiale disponibile comprende inoltre ampie casistiche di tumori neuroendocrini (carcinoidi, carcinomi di piccole cellule, tumori endocrini funzionanti, etc.) e di tumori del sistema nervoso (neuroblastomi, glioblastomi, astrocitomi), oltre a lesioni linfo-proliferative (linfomi, istiocitomi) (disponibili presso gli archivi delle Divisioni Universitarie di Anatomia Patologica dell’Università di Torino). Ciò al fine di definire l’eventuale espressione di cortistatina e somatostatina nel più ampio spettro di lesioni neoplastiche possibili e, di conseguenza, la eventuale presenza di tumori funzionanti con eventuali sintomatologie o effetti clinici correlati. Tale casistica comprende inoltre una raccolta di campioni congelati disponibili per indagini molecolari, che conta più di 100 tumori neuroendocrini del polmone, del pancreas, del tratto gastrointestinale, della tiroide e del surrene, nonché circa 200 carcinomi non-endocrini della mammella, del polmone, del colon, della tiroide e della prostata.

SINTESI FASE 1 - I dati emersi dalle indagini descritte in questa fase del progetto saranno confrontati e integrati con quelli emergenti dagli studi delle altre unità di ricerca. Il profilo di espressione di somatostatina e cortistatina in tessuti nervosi periferici verrà confrontato con i risultati degli studi di fisiologia programmati dall’unità di ricerca del Prof Merighi. Inoltre, tali dati serviranno da base per programmare gli esperimenti della Fase 2 del progetto, in cui gli effetti biologici di somatostatina e cortistatina saranno valutati in modelli in vitro, utilizzando linee cellulari di tessuti o neoplasie risultati esprimere tali ormoni e/o i loro siti di legame recettoriale.

FASE 2 = Effetti biologici di cortistatina, in confronto con somatostatina (e analoghi naturali o sintetici), su linee cellulari di tessuti esprimenti tali ormoni e/o specifici siti leganti recettoriali, tra cui cellule nervose, endocrine o ematologiche (e corrispondenti neoplasie).
Gli effetti biologici di somatostatina e cortistatina, e le interazioni o l’antagonismo con ghrelina e loro analoghi sintetici (ad es octreotide, GH secretagoghi etc) saranno studiate in linee cellulari da tessuti normali o neoplastici che saranno risultati esprimere uno di questi ormoni. Un effetto della cortistatina era stato precedentemente dimostrato dal nostro gruppo (Cassoni P et al, J Endocrinol Invest 2002) in linee di tumori tiroidei di origine follicolare e parafollicolare. Inoltre la cortistatina (ma non la somatostatina) è stata osservata in una linea di epatocarcinoma umano (Notas G et al, J Hepatol 2004). Lo spettro dei modelli in vitro possibili oggetto di studio è al momento molto ampio e difficile da definire a priori, e sarà modulato in funzione principalmente dei dati che verranno ottenuti nella Fase 1 del progetto. Per quanto riguarda gli aspetti tecnici, gli esperimenti di trattamento delle linee cellulari con ormoni nativi o analoghi sintetici e gli esperimenti di competizione saranno disegnati secondo i protocolli precedentemente descritti in analoghi studi su ghrelina e GH secretagoghi, cui si rimanda per i dettagli metodologici (Volante M et al, Am J Pathol 2003, Cassoni P et al, Eur J Endocrinol 2004).

RILEVANZA DEL PROGETTO
In sintesi, con questo studio ci proponiamo:
a) di elaborare un mappaggio preciso sulla distribuzione di somatostatina e cortistatina in tessuti umani fetali e adulti e corrispondenti tumori, nonché in animali transgenici knock-out per somatostatina e cortistatina. In parallelo, ci si attende di definire un profilo di espressione dei recettori per somatostatina, ghrelina, cortistatina;
b) di definire in vitro le interazioni ligando-recettore in campioni cellulari normali e patologici, specie in termini di controllo della crescita e regolazione della funzione ormonale (con particolare riferimento alle cellule derivate da ghiandole endocrine), nella ipotesi che la cortistatina o suoi analoghi sintetici possano rappresentare potenziali strumenti non solo diagnostici ma anche terapeutici, analogamente a quanto avvenuto con gli analoghi della somatostatina nella terapia di disfunzioni ormonali e neoplasie endocrine.