RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Somatostatina e peptidi correlati: distribuzione, effetti biologici e caratterizzazione di modelli transgenici

Università di riferimento

Università degli Studi di TORINO - MEDICINA INTERNA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Emanuela Arvat

Descrizione

Materiali e Metodi:
Animali
Le procedure sperimentali descritte saranno soggette all’approvazione del comitato etico locale. I topi Wild-type (Wt) (C57BL6), quelli knock-out (KO) per cortistatina (CST), somatostatina (SS) e i doppi KO per CST/SS saranno forniti dal laboratorio del Dr. Luis de Lecea (Stanford University, CA). Tutti gli animali saranno mantenuti in una stanza a temperatura controllata (23° C) e soggetti a un ciclo di 12 h luce/buio. Gli animali saranno alimentati con una dieta standard ed avranno libero accesso a cibo ed acqua. Durante gli esperimenti, gli animali saranno alloggiati uno per gabbia. L’anestesia verrà somministrata mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) con sodio pentobarbital (50 mg/kg peso corporeo).

Determinazioni ormonali
In tutti gli animali verrà valutata la secrezione di insulina, ghrelin acilato e des-acilato, SS, CST, leptina e glucagone sia in condizioni basali sia dopo stimolazione con glucosio. I campioni di sangue saranno raccolti a tempi differenti dalla zona retro-orbitale oculare o per sanguinamento della vena caudale. Il glucosio (1.5 g/kg i.p.) verrà iniettato nei topi dopo 12 h di digiuno. I campioni di sangue saranno raccolti a tempi diversi dopo la stimolazione con glucosio, in provette contenenti 40 mM EDTA. I campioni verranno centrifugati a 2000 giri per 5 min e il plasma sarà utilizzato per la determinazione dell’insulina (RIA). I campioni di plasma o di siero saranno utilizzati per le determinazioni dei diversi ormoni mediante determinazione RIA. Per la determinazione dei livelli di glucagone (RIA), i topi saranno mantenuti a digiuno per 12 h e successivamente stimolati con insulina i.p. 5 IU/kg.
In tutti gli animali sarà determinata la secrezione di GH, IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, ACTH, corticosterone, PRL, TSH, FT3, FT4, FSH, LH, testosterone ed estradiolo in condizioni basali.
Inoltre, i topi verranno stimolati con differenti sostanze con successiva determinazione di ormoni specifici, a tempi diversi (0, 5, 15, 30, 45 and 60 min); nello specifico:
1) GHRH (250 µg/kg i.p.) per GH;
2) SS o CST 1-29 (i.p. 6-250 µg/kg nmol) per GH, insulina e glucosio;
3) Ghrelin acilato o non acilato (250 µg i.p.) per GH, insulina and glucosio, ACTH, corticosterone, FSH, LH, testosterone o estradiolo;
4) CRH (0.1 µg/kg i.p.) per ACTH e corticosterone;
5) TRH (30 mg/kg i.p.) per TSH, FT3, FT4 e PRL;
6) LHRH (1 µg/kg i.p.) per FSH, LH, testosterone o estradiolo.

Secrezione acida gastrica
Il volume del contenuto gastrico sarà registrato nel topo mediante legatura del piloro, come precedentemente descritto (Broccardo M et al 2005) e la concentrazione dell’idrogeno determinata mediante titolazione a pH 7.0 con 0.1 N NaOH mediante uno strumento automatico Crison TT2022.

Svuotamento gastrico
Lo svuotamento gastrico verrà eseguito come precedentemente descritto (Scarpignato et al 1980). I topi saranno sacrificati 10 e 30 min dopo un pasto di prova (0.3 ml/topo di soluzione contenente 0.05% rosso fenolo). Il contenuto dello stomaco verrà rimosso, soggetto a reazione acido/basica e l’assorbanza del campione letta con uno spettrofotometro a 560 nm.

Transito intestinale (intestino tenue)
La motilità intestinale sarà determinata dopo un pasto a base di carbone (0.2 ml/topo di una sospensione con 10% di carbone attivo in 5% di gomma arabica), come precedentemente descritto (Izzo et al 2001). In ciascun animale, verrà misurata 20 min dopo, la distanza percorsa dal carbone, espressa come percentuale della lunghezza totale dell’intestino tenue dallo sfintere pilorico alla giunzione ileo-cecale.

Secrezione dall’intestino tenue
La secrezione intestinale verrà misurata mediante il metodo di “interpooling” (Rao et al 1997). L’intestino tenue di ogni topo sarà prelevato e pesato. La differenza del peso intestinale tra il topo di controllo normale e quello trattato con olio di ricino (0.2 ml/topo 30 min prima del sacrificio) verrà considerata come l’accumulo di fluido intestinale indotto dall’olio di ricino.

Transito attraverso il colon
Il colon distale sarà misurato come precedentemente descritto (Raffa et al 1987), determinando il tempo necessario per l’espulsione di una pallina di vetro inserita nel colon distale di ciascun topo.

Diarrea indotta dall’olio di ricino
La diarrea verrà indotta mediante somministrazione orale di olio di ricino (0.2 ml/topo) come precedentemente descritto (Akah 1999) e contando il numero sia delle gocce diarroiche bagnate sia di quelle asciutte ogni ora, per un periodo di 4 ore.

Spasmi indotti dall’acido acetico
Il dolore infiammatorio viscerale verrà indotto come precedentemente descritto (Jones et al 2005), mediante somministrazione di acido acetico intraperitoneale (0.1ml/10 g b.w. di una soluzione al 0.55%). Le risposte nocicettive saranno determinate contando il numero di spasmi nei 5 e 10 min successivi alla somministrazione di acido acetico.

Determinazione della distensione colon-rettale (CRD)
La risposta viscerale-motoria (VMR) ed il dolore associato alla distensione colon-rettale verranno quantificate mediante la procedura di Arvidsson (Arvidsson et al 2006). L’attività elettrica della muscolatura addominale (elettromiografia [EMG] mediante impianto cronico di elettrodi) e le variazioni di pressione nella distensione del palloncino di polietilene inserito nel colon distale, a 0.5 cm dall’ano (risposta meccanica), verranno registrate simultaneamente nel topo cosciente durante CRD (ascensione fasica 10-80 mmHg o ripetitiva 55 mmHg). Verrà utilizzato uno specifico software per quantificare l’intensità dell’EMG ed i segnali pressori del palloncino, in accordo con il “timing pulse, come descritto (Arvidsson et al 2006).

Colite indotta dall’acido trinitrobenzensolfonico
Un modello di infiammazione intestinale indotta dall’acido 2,4,6-trinitrobenzensolfonico (TNBS) verrà utilizzato nel topo, secondo le procedura precedentemente descritta (Neurath et al 1995). L’applicazione rettale del TNBS (3 mg) nel topo induce, 3-5 giorni dopo il trattamento, una colite transmurale con severa diarrea, perdita di peso corporeo, prolasso rettale e sintomi che mimano alcune caratteristiche della malattia di Crohn nell’uomo. Gli animali saranno monitorati ogni giorno per l’insorgenza della diarrea ed il sanguinamento rettale, per la perdita di peso corporeo e la sopravvivenza. Il tessuto intestinale verrà analizzato per l’analisi immunoistologica con anticorpi monoclonali anti-CD4, CD-11 ed anti-TNF-a.

Test nocicettivo termico
Il test nocicettivo termico verrà eseguito utilizzando tre procedure classiche. Il “tail-flick test”, precedentemente descritto (D’Amour 1941), il “hot plate test” (Eddy et al 1953) per i tessuti senza infiammazione e l’iperalgesia termica indotta nella zampa dalla carragenina (Hargreaves et al 1988), utilizzando uno strumento photobeam Plantar Test.

Test nocicettivo meccanico
La soglia nocicettiva della zampa infiammata con carragenina o capsaicina verrà effettuato seguendo il metodo di Randall-and Sellitto (1957), dove uno stimolo pressorio è applicato sulla zampa infiammata con un analgesiometro, registrando l’intensità dello stimolo che provoca una reazione di dolore.

Risultati attesi:
Dai risultati della ricerca ci si aspetta di vedere se la SST e la CST siano in grado o meno di vicariare le rispettive azioni biologiche e di vedere se il profilo ormonale, nonché le risposte fisiopatologiche e farmacologiche siano differenti negli animali normali, ko per i singoli peptidi o per entrambi i peptidi.
La caratterizzazione endocrino-metabolica e farmacologica di questi animali potrà fornire un importante contributo per la conoscenza della fisiologia e della fisiopatologia dei sistemi somatostatinergico e cortistatinergico, del loro legame biologico e dell’influenza di tali sistemi nella modulazione dell’assetto endocrino-metabolico e delle risposte infiammatorie e nocicettive. Tali risultati potranno inoltre aprire nuove prospettive cliniche correlate alla disponibilità di sintesi di agonisti/antagonisti dei recettori per la cortistatina.