RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Somatostatina e peptidi correlati: distribuzione, effetti biologici e caratterizzazione di modelli transgenici

Università di riferimento

Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA - SCIENZE BIOMEDICHE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Rita Bardoni

Descrizione

Proponiamo di studiare il ruolo della somatostatina (STT) e del peptide correlato cortistatina (CTT) nella modulazione della trasmissione del dolore nelle corna dorsali di midollo spinale di topo, utilizzando prevalentemente tecniche elettrofisiologiche. Ci concentreremo in particolare sulla trasmissione mediata dal glutammato tra fibre afferenti primarie e neuroni delle corna dorsali in fettine di midollo spinale. Questo preparato permette lo studio di circuiti sinaptici intatti e la caratterizzazione sia dell'input sinaptico attivato che dei neuroni da cui si registra. Intendiamo caratterizzare gli effetti modulatori di STT e CTT, applicate in modo esogeno, durante la normale trasmissione nocicettiva (dolore acuto) e in condizioni di sensibilizzazione centrale o aumentata eccitabilità neuronale, riconducibili ad alcune forme di dolore cronico. Infine, utilizzando topi transgenici knock-out per i due ormoni, studieremo il ruolo di STT e CTT endogene nel regolare l’elaborazione e la trasmissione nocicettiva a livello spinale.

In dettaglio, intendiamo rispondere ai seguenti quesiti:

Primo anno

1) E’ possibile caratterizzare il tipo di fibra afferente primaria stimolata nel preparato di fettina di midollo spinale di topo? Quali metodi analitici possono essere applicati per discriminare il sito di azione (pre- o post-sinaptico) di un neuromodulatore?
Questa prima parte del progetto rappresenta una fase preliminare nella quale si sviluppano i protocolli sperimentali e analitici necessari a caratterizzare gli effetti della somatostatina e cortistatina.
Si registreranno, utilizzando la tecnica del patch-clamp, correnti sinaptiche glutamatergiche (EPSC, vedi figure) da neuroni delle lamine I e II in fettina di midollo spinale di topo (P15-P25). I diversi tipi di fibre afferenti primarie, attivati dalla stimolazione della radice dorsale attaccata alla fettina, verranno identificati sulla base dell’intensità di stimolazione e della probabilità di insorgenza di failure sinaptiche durante la stimolazione ad alta frequenza. I dati saranno analizzati off-line utilizzando procedure statistiche derivate dall’analisi quantale (analisi del coefficiente di variazione e della probabilità di failures, simulazioni con il metodo Montecarlo), al fine di differenziare meccanismi di modulazione pre- e postsinaptica. Alcuni dati preliminari sono mostrati nelle figure 1 e 2.



Figura 1: Esempio di modulazione presinaptica EPSC glutamatergiche registrate da un neurone della lamina II di topo ed evocate dalla stimolazione della radice dorsale (all'intensità delle fibre C). Le EPSC sono state registrate in controllo (sinistra) e in presenza di AMPA 250 nM (a destra), un agonista che agisce anche a livello presinaptico [21]. Si noti che la depressione della risposta in presenza di AMPA è accompagnata da un aumento della variabilità sinaptica e dalla comparsa di failures. Nell'inserto: schema delle condizioni sperimentali



Figura 2: Esempio di modulazione postsinaptica EPSC glutamatergiche evocate registrate da un diverso neurone della lamina II. Le EPSC sono state registrate a due diversi potenziali di membrana, simulando una modulazione di tipo postsinaptico. A -55 mV sia l'ampiezza che la variabilità delle risposte sono diminuite e non compaiono failures.

2) Quali sono le azioni modulatorie esercitate da STT e CTT sulla trasmissione sinaptica glutamatergica nelle corna dorsali?
Verranno registrate dai neuroni delle corna dorsali EPSC mediate dal glutammato (sia spontanee che evocate da stimolazione delle fibre afferenti primarie). Si testeranno gli effetti di STT e CTT su vari parametri delle correnti (ampiezza, cinetica e, solo per le correnti spontanee, frequenza). Si applicheranno metodi dell’analisi quantale (vedi punto 1) per determinare se i due peptidi svolgono modulazioni presinaptiche.
Si eseguiranno inoltre registrazioni di potenziali postsinaptici (EPSP) evocati da stimolazioni delle fibre afferenti (singole e ripetute); si studierà l’effetto dell’applicazione di STT e CTT sulla frequenza di scarica dei potenziali d’azione sovrapposti agli EPSP, caratterizzando anche l’input attivato.
Al fine di monitorare l’attività in una più ampia popolazione neuronale, si compiranno infine alcuni esperimenti di calcium-imaging al microscopio confocale per determinare le variazioni di calcio intracellulare spontanee e prodotte dalla stimolazione delle fibre afferenti, in presenza e assenza di STT e CTT.

Secondo anno

3)E' possibile identificare un effetto di regolazione da parte di STT e CTT su meccanismi di plasticità sinaptica e sensibilizzazione centrale nelle corna dorsali? I due ormoni sono coinvolti nella regolazione del firing in condizioni di aumentata eccitabilità dei neuroni?
Protocolli di stimolazione ripetuta della radice dorsale, a bassa e alta frequenza, verranno utilizzati per indurre, rispettivamente, il fenomeno del wind-up e dell'LTP in neuroni delle lamine I e II. Gli effetti di STT e CTT sui due fenomeni verranno quindi testati.
Si indurrà inoltre attività di tipo epilettico, considerata un modello di dolore neuropatico [22], in neuroni delle corna dorsali, tramite applicazione di 4-aminopiridina. Verrà quindi studiata l’azione modulatoria dei due peptidi su frequenza di scarica, latenza di onset e durata dell’attività epilettica.

4) Come sono distribuiti i recettori per la somatostatina a livello subcelllulare? E’ possibile riconoscere la presenza di recettori presinaptici?
La presenza di recettori per la STT verrà rivelata utilizzando tecniche immunocitochimiche a livello ottico, su sezioni di midollo spinale di topo. Studi ultrastrutturali sulla distribuzione dei recettori sui terminali delle fibre afferenti e sui neuroni delle corna dorsali verranno poi compiuti utilizzando tecniche di microscopia elettronica. Questa parte del progetto verrà sviluppata in collaborazione con l’unità MERIGHI, esperta nella caratterizzazione morfologica di circuiti sinaptici nel midollo spinale.

5) Quali sono le proprietà della trasmissione sinaptica glutamatergica nelle corna dorsali in topi transgenici knock-out per i due peptidi?
Si eseguiranno registrazioni da neuroni delle corna dorsali in fettina derivanti da topi transgenici knock-out solo per la CTT e per entrambe STT e CTT. Si studieranno le caratteristiche della trasmissione sinaptica glutamatergica tra fibre afferenti e neuroni della lamina I e II e le proprietà di firing dei neuroni.

Procedure sperimentali

Registrazioni in patch-clamp da fettine di midollo spinale
Le registrazioni di EPSC e EPSP verranno eseguite su neuroni delle lamine I e II in fettina, ottenute dal midollo spinale di topi (P15-25). Gli animali verranno anestetizzati con alotano, decapitati e il midollo spinale (nella regione lombare) verrà isolato. Si otterranno fettine dello spessore di circa 500 micrometri con attaccato un moncone della radice dorsale. Durante le registrazione, le fettine verranno continuamente perfuse da una soluzione salina (di Krebs) della seguente composizione (in mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, 25 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 25 glucosio, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH 7.4, osmolarità 320 mOsm. Nella soluzione verrà fatto gorgogliare carbossigeno (95% O2 - 5% CO2). Le registrazioni verranno ottenute, a temperatura ambiente, da neuroni visualizzati al monitor di una telecamera, utilizzando la tecnica del patch-clamp in configurazione di cellula intera. La soluzione di riempimento degli elettrodi (intracellulare) per le registrazioni in voltage-clamp avrà la seguente composizione (in mM): 130 Cesio gluconato, 10 CsCl, 1 CaCl2, 11 EGTA, 10 HEPES e 2 ATP-Mg, pH portato a 7.2 con NaOH, osmolarità portata a 305 mM con saccarosio. La soluzione intracellulare per le registrazioni in current-clamp avrà la seguente composizione (in mM): 130 Potassio gluconato, 10 KCl, 1 CaCl2, 11 EGTA, 10 HEPES e 2 ATP-Mg, pH portato a 7.2 con NaOH, osmolarità portata a 305 mM con saccarosio. Le correnti postsinaptiche evocate verranno generate tramite stimolazione della radice dorsale con un elettrodo a suzione di vetro. I gruppi di fibre attivati verranno distinti sulla base della soglia di stimolazione (<100 microA: fibre di tipo A; > 100 microA: fibre di tipo C). I dati verranno acquisiti su computer tramite il software pClamp (Axon Instruments) ad analizzati off-line, usando lo stesso software o il programma MiniAnalysis (Synaptosoft).
Al fine di determinare la morfologia dei neuroni da cui si registra, le cellule verranno iniettate con il colorante fluorescente Lucifer yellow (lithium salt, 1 mg/ml) durante le registrazioni in patch-clamp. I neuroni riempiti con Lucifer yellow verranno osservati dopo 10 minuti con un microscopio diritto corredato di epifluorescenza.

Calcium imaging su fettine di midollo spinale
Le fettine, ottenute come descritto sopra, verranno incubate in soluzione di Krebs contente il colorante fluorescente sensibile al calcio Oregon Green e acido pluronico (0.02%)a 37°C per 40-50 minuti, agitate continuamente. Le fettine verranno successivamente poste sul tavolino di un microscopio confocale (Leica TCS SP2)dove verrà usato un laser ad argon per l'eccitazione e la luce emessa (488 nm) verrà raccolta da un fotomoltiplicatore. Le immagini verranno acquisite a intervalli compresi tra 2 e 30 secondi e successivamente integrate. Durante le registrazioni le fettine saranno continuamente perfuse con souluzione di Krebs (2ml/min). L'analisi delle variazioni di concentrazione di calcio intracellulare sarà compiuta off-line utoilizzando l'apposito software (Leica).

Immunocitochimica
Tecniche immunocitochimiche a livello ottico: Ratti neonati anestetizzati con alotano verranno perfusi con 20 ml di tampone fosfato 0.1 M (PB) seguito da 20 ml paraformaldeide al 4%, tramite iniezione intracardiaca. Il midollo spinale verrà poi estratto ed ulteriormente fissato (per 2/12 ore) in paraformaldeide al 4%. Dopo lavaggio in 0.1 M PB, il midollo spinale sarà trasferito in una soluzione di saccarosio al 30% (in 0.1 M PB) per 24 ore. La porzione lombare del midollo verrà isolata e verranno ottenute sezioni trasversali dello spessore di 15-30mm tramite microtomo a vibrazione. Anticorpi primari specifici per i recettori per la somatostatina verranno diluiti in PBS con aggiunta di 0.1% Triton X-100 ed 1% siero caprino (PBS-TG). Per la marcatura con anticorpi primari IgG, le sezioni verranno pre-incubate in una soluzione bloccante costituita da 10% siero caprino diluito in PBS con aggiunta di 0.1% Triton X-100. Dopo l'applicazione dell'anticorpo primario e ulteriori lavaggi in PBS, le sezioni verranno incubate in una soluzione di anticorpo secondario marcato con fluorescina, diluito in PBS-TG.
Tecniche immunocitochimiche a livello elettronico: Verranno impiegate tecniche all’oro colloidale su sezioni ultrasottili di materiale incluso in resine epossidiche o criosostituito. Si utilizzerà il metodo di post-inclusione con l’impiego di particelle d’oro colloidale (10, 20, 30nm di diametro) e il metodo di pre-inclusione con l’impiego di specifici anticorpi secondari contemporaneamente coniugati con un fluorocromo (per la visualizzazione al microscopio ottico) e con particelle d’oro colloidale (per la visualizzazione al microscopio elettronico).