RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Nuovi metodi molecolari di diagnosi per lo studio dell'ecologia e dell'epidemiologia di specie terricole di Phytophthora potenzialmente pericolose per gli ecosistemi seminaturali, forestali e agrari

Università di riferimento

Università degli Studi "Mediterranea" di REGGIO CALABRIA - GESTIONE DEI SISTEMI AGRARI E FORESTALI -GESAF- - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Gaetano Magnano Di San Lio

Descrizione

OBIETTIVI
L'obiettivo di questa UR è mettere a punto un nuovo metodo di diagnosi molecolare basato sulla Real Time PCR con primer genere-specifici e specie-specifici, disegnati sulle sequenze ITS del rDNA, per il monitoraggio delle diverse specie di Phytophthora in ecosistemi seminaturali e naturali

I° ANNO

La prima fase comprende la messa a punto di una nuova tecnica molecolare che consenta l’identificazione e il monitoraggio delle diverse specie di Phytophthora presenti nel suolo, in corsi o specchi d’acqua e in materiale vegetale infetto.

Campionamento
Verrà effettuato un campionamento di suolo e acqua provenienti da diverse aree di particolare interesse naturalistico o con evidenti caratteristiche di naturalita’ nelle diverse stagioni dell’anno.
Le aree verranno selezionate in funzione delle caratteristiche stazionali e vegetazionali, in modo da essere il piu’ possibile rappresentative di diverse tipologie ambientali. Per ciascun sito verranno rilevate coordinate geografiche, temperatura e precipitazioni medie annue, inoltre verranno determinati l’indice xerotermico di Bagnouls & Gaussen e i principali parametri del suolo (pH, tessitura, struttura, ecc.).

Isolamento di Phytophthora spp.
Su un aliquota di ciascun campione, sia di suolo che di acqua, verrà eseguito il “bait-test”, una tecnica di isolamento molto efficace in cui giovani foglie di rododendro (Rhododendron ponticum), fungeranno da esca per i propaguli di Phytophthora in una diluizione del terreno con acqua distillata o soluzione minerale di Petri(Jung et al., 1996). Le foglie con sintomi verranno successivamente poste su substrato selettivo PARPNH e le colonie di Phytophthora così ottenute verranno conteggiate e utilizzate per confrontare i dati ottenuti su base molecolare.
In ogni saggio verrà inserito un controllo negativo con suolo sterile ed uno con acqua distillata.

Estrazione del DNA
L’estrazione del DNA da campioni (di terreno e acqua) provenienti da ambienti naturali risulta spesso complicata per la contemporanea presenza di componenti che influiscono negativamente sulla successiva fase di amplificazione. Si tratta principalmente di tannini, acidi umici e polifenoli, in grado di inibire l’attivita’ della Taq-polimerasi e quindi compromettere la reazione di PCR.
Verranno messi a punto, pertanto, appositi protocolli di estrazione, differenziati per campioni di suolo e acqua.
Particolarmente rilevante risulterà la successiva fase di purificazione del DNA. Verranno effettuate diverse prove al fine di ridurre al minimo le inibizioni e contemporaneamente di massimizzare la quantita’ di DNA amplificabile.
Il DNA estratto verrà quantificato allo spettrofotometro, diviso in aliquote e conservato a -20°C.

Amplificazioni mediante PCR
Tutti i primer usati in questo studio saranno localizzati su varie porzioni del DNA ribosomiale (rDNA).
Le sequenze ITS (Internal Transcribed Regions) di questo gene verranno utilizzate per sviluppare una serie di nuovi primer, specifici per specie del genere Phytophthora, da impiegare secondo la tecnica di amplificazione “nested”. Primer generici saranno adoperati invece in singola amplificazione PCR.

Primer generici
Al fine di valutare l’amplificabilita’ del DNA estratto verrà eseguito un primo screening con primer generici. Questo saggio potrà essere effettuato con PCR convenzionale o con Real Time-PCR.
I primer ITS6 e ITS4 verranno adoperati in una PCR convenzionale. Sono localizzati rispettivamente alla fine del gene 18S e all'inizio del 28S e comprendono al loro interno le regioni intergeniche ITS1 ed ITS2 e il gene 5.8S. Questi primer generalmente vengono utilizzati in singola amplificazione e danno origine ad un prodotto di PCR di circa 900 bp. Qualora non sia osservabile alcun prodotto verrà eseguito un’ulteriore controllo con DNA diluito. Questi primer verranno inoltre utilizzati per PCR direttamente da micelio, sugli isolati ottenuti dal baiting. Gli eventuali amplificati verranno direttamente sequenziati al fine di determinare con esattezza le specie di Phytophthora.
Il test con Real Time PCR verrà eseguito con una sonda TaqMan e dei primer universali, molto sensibili, in grado di amplificare un frammento di circa 70 bp dal gene 18S dell'rDNA di tutti gli eucarioti. Questa tecnica di analisi in tempo reale consentirà una prima rapida determinazione del DNA estratto.

Primer specifici
Verranno saggiate l’efficienza e la specificita’ dei vari primer, appositamente disegnati per questo studio.
La specificita’ di ogni coppia di primer verrà preliminarmente analizzata tramite allineamento con le sequenze ITS di vari Oomiceti disponibili presso il National Center for Biotecnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov). La selezione si baserà sulla capacita’ di diagnosticare tutte le specie di Phytophthora evitando contemporaneamente l’amplificazione delle specie affini dei generi Pythium e Peronospora, che generalmente risultano piu’ abbondanti nei campioni di origine naturale. La selettività dei primer verrà successivamente ulteriormente verificata tramite saggio direttamente sul DNA genomico delle specie di Phytophthora piu’ rilevanti .
Verrà, inoltre, confrontata la sensibilita’ dei primer sia con DNA estratto da coltura pura che con DNA estratto da suolo e acqua.

Clonaggio e sequenziamento
Poiché è probabile che i campioni positivi risulteranno costituiti da più di una specie di Phytophthora, i frammenti di DNA ottenuti dall’amplificazione con i primer specifici verranno clonati tramite il vettore pGEM-T (Promega).
Il plasmide modificato, contenente i frammenti di DNA, verrà inserito in cellule batteriche di Escherichia coli (JM109, Promega) competenti per la trasformazione.
Tali cloni verranno quindi amplificati, con i primer plasmidici T7 ed SP6, e successivamente sequenziati.
Tutte le sequenze ottenute verranno elaborate tramite il programma Sequence Navigator (Applied Biosystems), su computer Macintosh.

Analisi filogenetica
La regione ITS1, essendo una sequenza esonica, è caratterizzata da un'elevata variabilità intraspecifica e quindi risulta idonea per discriminare le diverse specie di Phytophthora.
L’identificazione delle sequenze verrà effettuata tramite l’analisi BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) della banca dati NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Per lo studio filogenetico, le varie sequenze dei campioni e le sequenze delle specie di riferimento verranno allineate tramite il programma Clustal-X. Ciò consentirà di evidenziarne il grado di variazione. Per visualizzare il filogramma, verrà utilizzato il programma TOPALI .
Questa prima fase della ricerca, cioè la messa a punto di un metodo di “nested-PCR”che possa essere utilizzato per determinare diverse specie di Phytophthora presenti contemporaneamente nello stesso campione, verrà svolta in stretta collaborazione con il gruppo di ricerca del Dr D.E.L. Cooke dello Scottish Crop Research Institute (Invergworie, Scozia, Regno Unito).


II° ANNO

Validazione del metodo e studi epidemiologici
Nella fase successiva del progetto, per validare il metodo, verranno effettuati dei campionamenti sistematici in ambienti naturali, seminaturali e rinaturalizzati, di particolare interesse naturalistico, per monitorare la presenza di specie di Phytophthora e determinare le fluttuazioni stagionali di ciascuna specie.