RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Transitoria "down-regulation" di cAMP and cGMP nei gangli basali dei roditori durante le discinesie da levodopa in un modello di parkinsonismo sperimentale: ruolo delle fosfodiesterasi caratteristiche dello striato e un nuovo approccio alla prevenzione delle discinesie.

Università di riferimento

Università degli Studi de L'AQUILA - BIOLOGIA DI BASE ED APPLICATA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Mauro Giorgi

Descrizione

Il nostro recente lavoro in cui abbiamo dimostrato variazioni sostanziali della via di traduzione nitrinergica nello striato di ratto monolateralmente deafferentato dalle proiezioni dopaminergiche afferenti allo striato dalla sostanza nera è stato già descritto(Sancesario et al., 2004). Tuttavia, lo studio di queste variazioni e delle variazioni di PDE1, PDE7B e PDE10A in questo modello di parkinsonismo sperimentale non può essere limitato allo striato, me deve essere esteso a considerare anche il globo pallido. La lesione della sostanza nera e delle sue fibre dopaminergiche non induce infatti soltanto una denervazione del complesso caudato putamen, ma anche del globo pallido, con il quale la sostanza nera risulta direttamente collegata attraverso collaterali della via nigro-striatale. Dobbiamo inoltre supporre che striato e globo pallido debbano risultare naturalmente dotati di differenti isoforme di PDE, giacché mentre lo striato è dotato sia di una ricchissima innervazione dopaminergica sia nitrinergica, il globo pallido è privo di una significativa innervazione nitrinergica e dovrebbe quindi essere intrinsicamente dotato di bassi livelli di cGMP. Infine, va notato che, come è stato già ricordato, nel nostro precedente lavoro non è stato chiarito ne' il meccanismo dell'induzione degli aumentati livelli di PDE1B, ne' se questo incremento possa avere un ruolo nel determinismo della sintomatologia motoria parkinsoniana, o se non rappresenti invece una sorta di meccanismo di compenso della deafferentazione striatale. Inoltre, mentre la variazione dei livelli di cGMP risulta in linea con l'aumento dei livelli di PDE1B la concomitante diminuzione del cAMP striatale suggerisce una complessa regolazione in cui oltre a variazioni di altre isoforme di fosfodiesterasi potrebbero essere coinvolti gli enzimi sintetici ovvero le ciclasi. Di notevole interesse risulta anche essere lo studio degli stessi nucleotidi ciclici ed enzimi catabolici nel modello murino leso e trattato con L-DOPA. Questa molecola che ancora risulta essere il farmaco d’elezione per il trattamento del Parkinson determina,come effetto collaterale, disturbi discinetici difficilmente trattabili. Anche nel modello murino l’L-DOPA induce discinesie di varia intensità e durata che possono essere facilmente monitorate e quantificata. Le discinesie non dipendono dall’azione della levo-dopa di per se stessa, ma dalla azione della dopamina che nello striato viene sintetizzata dai terminali dopaminergici residui ed in sede extraneuronale anche dopo lesione della sostanza nera. E’ necessario tuttavia un trattamento a lungo termine con levo-dopa affinché l’abbondante sintesi di dopamina nello striato denervato, non fisiologica per intensità e durata, determini un’abnorme risposta dei neuroni striatali ed una disfunzione indotta “de novo” nei circuiti cortico-strio-pallidali. In modelli animali con lesione della sostanza nera sono state descritte molteplici modificazioni biochimiche nei neuroni striatali che comprendono: 1) ipersensibilità dei recettori D1 e riduzione dei recettori del glutammato NMDA tipo 1; 2) alterazioni dei livelli dei neuropeptidi sostanza P ed enchefalina; 3) modificazioni di fondamentali modulatori intracellulari quali “protein kinase A” (PKA), “cAMP response element-binding protein” (CREB), DARP-32; 4) infine l’espressione di numerosi geni coinvolti nella omeostasi del calcio e nella plasticità cellulare e sinaptica. Questi effetti, riscontrabili dopo un trattamento cronico con levo-dopa, in ultima analisi non sono l’espressione di una raggiunta tossicità dei livelli di dopamina, ma appresentano l’estremo risultato delle azioni proprie della dopamina, capace di indurre nei neuroni striatali sia effetti acuti, rappresentati da modificazioni ioniche e sintesi del secondo messaggero cAMP, sia effetti di lunga durata attraverso la modulazione genica. Sebbene l’insorgenza delle discinesie presupponga una lunga fase di induzione con L-DOPA e quindi lo sviluppo di alterazioni a lungo termine nei neuroni striatali, la manifestazione delle discinesie è solitamente di breve durata, legata ai livelli di L-DOPA/dopamina nello striato e quindi probabilmente dipendente dagli effetti a breve termine della dopamina sulla attività della adenilato ciclasi e sulla sintesi del secondo messaggero cAMP attraverso la sua azione sui recettori D1 e D2. U’ipotesi, interessante, nasce da nostre osservazioni sullo striato di ratti lesionati e trattati con L-DOPA (Giorgi et al. 2007 submitted). In questo modello sperimentale abbiamo osservato un drammatico crollo dei livelli di cAMP e cGMP al picco delle discinesie dopo l’ultima somministrazione di L-DOPA. Questa diminuzione potrebbe essere il risultato di una ridotta sintesi di cAMP e cGMP oppure di un aumentato catabolismo da parte delle fosfodiesterasi. Questo risultato è assolutamente inatteso ma non sorprendente se teniamo presente il lavoro di Rolf Kotter (Kotter 1994), sulla integrazione post-sinaptica dell’azione del glutammato e della dopamina nello striato. La convergenza del “release” di glutammato e dopamina sui neuroni striatali può interagire in modo sinergico su vie intracellulari comuni che attraverso rispettivamente l’influsso di calcio e la stimolazione della adenilato ciclasi conduce alla sintesi di cAMP, i cui livelli sono mantenuti costanti allo “steady state” attraverso la degradazione da parte delle fosfodiesterasi. Tuttavia un eccesso di influsso di calcio al di sopra di 1µm riduce in modo drammatico i livelli di cAMP attraverso un effetto combinato di inibizione della adenilato ciclasi e di attivazione della fosfodiesterasi calcio dipendente. Alla luce del lavoro di Kotter potremmo pertanto considerare le discinesie come il risultato di un processo bifasico nell’azione della levodopa/dopamina, caratterizzato da una prima fase di equilibrio tra i processi di sintesi e di degradazione del cAMP e da una seconda fase quando il processo di degradazione del cAMP prevale sulla sintesi. Glutammato dipendente potrebbe essere anche l’induzione di PDE1B già osservata nel nostro lavoro del 2004 (Sancesario et al., 2004).

Scopo del nostro progetto è quindi di verificare i processi di degradazione dei nucleotidi ciclici e degli enzimi catabolici e in particolare: a) studiare l'attività e la distribuzione comparativa nello striato e nel globo pallido sia dei tre isoforme della PDE1(A,B eC) oltre a PDE7B e PDE10 cercando di comprendere il meccanismo biochimico (se glutammato dipendente) che e' alla base della induzione di PDE1B e delle eventuali variazioni di espressione delle altre isoforme considerate nel modello murino di Parkinson; b)valutare nello stesso modello sperimentale eventuali variazioni di altre isoforme di PDE espresse anche a bassi livelli. c)valutare, rispetto agli animali di controllo i livelli di nucleotidi ciclici e le variazioni di espressione delle stesse isoforme negli animali trattati con L-DOPA con particolare attenzione alla condizione di picco delle discinesie e a tempi lunghi di trattamento. d) valutare in esperimenti in vitro le caratteristiche di inibizione di noti inibitori di fosfodiesterasi verificandone sia la potenza inibitoria sulle isoforme espresse nei nuclei della base sia la specificità per l'utilizzo in esperimenti con animali trattati con L-DOPA;

Il modello sperimentale sarà prodotto dalla unità di ricerca di Roma (001) ledendo stereotassicamente nel ratto la sostanza nera di un lato e studiando con metodi immunoistichimici variazioni plastiche dei neuroni dello striato e del globo pallido ipsi e controlaterale dopo due mesi. Mediante tecniche di immunoblot verrà valutata l'espressione, e eventuali variazioni, oltre che di PDE1B, A, C, PDE7B, PDE10 anche di tutte le altre famiglie di fosfodiesterasi utilizzando anticorpi specifici sia acquistati da fornitori commerciali, sia prodotti e caratterizzati direttamente dalla presente unità di ricerca. I dati di espressione verranno anche confermati mediante tecniche di immunolocalizzazione. RT-PCR quantitative, utilizzando primers specifici, permetteranno di verificare se le eventuali variazioni di espressione osservate siano o meno a livello trascrizionale. Si cercherà poi di studiare il meccanismo biochimico dell'induzione di PDE1B e di altre PDE utilizzando modelli sperimentali, quali cellule striatali dissociate e/o il classico modello di fettine di striato mantenute in condizioni fisiologiche. Con questi sistemi sperimentali si potrà verificare facilmente sia l’induzione di PDE1B (immunoblot) o le variazioni qualitative e quantitative delle altre PDE. Se queste variazioni avranno luogo sarà possibile dettagliare il meccanismo biochimico che ne è alla base utilizzando molecole che selettivamente inibiscano i più noti segnali cellulari di induzione o repressione genica. Le fettine permetteranno anche una valutazione funzionale elettrofisiologica delle cellule striatali sottoposte agli inibitori sopra descritti. Verrà poi estratta attività enzimatica dalle diverse regioni nuclei della base sani e lesi, che verrà misurata con metodo radioattivo in condizioni basali e dopo aggiunta di calmodulina esogena. Sulla stessa attività verranno testati diversi inibitori di fosfodiesterasi allo scopo di scegliere il più adatto per la sperimentazione successiva. Verranno anche utilizzate tecniche cromatografiche (cromatografia a scambio ionico, ultrafiltrazione,cromatografia per affinità ecc.) allo scopo di purificare le isoforme di PDE dall'area striatale e pallidale e verificare sulle stesse isoforme purificate la potenza e la specificità degli inibitori. Gli inibitori scelti verranno utilizzati dall'unità di ricerca di Roma (001)sul modello murino lesionato e trattato con L-DOPA, allo scopo di verificare se lo stesso inibitore possa revertire gli effetti discinetici dell'L-DOPA. Su questi animali trattati, tramite microdialisi (effettuati dall'unità di ricerca di Catanzaro) e saggi radioimmunologici (RIA) o immunoenzimologici (EIA), verranno valutate in tempo reale le variazioni dei nucleotidi ciclici in animali trattati solo con L-DOPA ed in quelli trattati sia con L-DOPA che con l'inibitore selezionato. Questi ultimi ratti verranno sacrificati e verranno valutate sui loro striati eventuali variazioni di espressione delle PDE, con le già menzionate tecniche di immunoblot e di RT-PCR.