RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Nuove frontiere nella stratificazione delle leucemie acute linfoidi (LAL): integrazione tra citogenetica non-convenzionale, genomica e post-genomica

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - BIOTECNOLOGIE CELLULARI ED EMATOLOGIA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Roberto Foà

Descrizione

BACKGROUND. Negli ultimi 2 anni, il progetto internazionale MILE (Microarray Innovations in LEukemia), ideato nell’ambito dell’ELN (European Leukemia Network) e sponsorizzato dalla RMS (Roche Molecular Systems) ha permesso di dimostrare che i microarrays possono essere impiegati in un contesto diagnostico, in quanto forniscono risultati altamente riproducibili in vari centri, una volta che la metodica è messa a punto è di facile esecuzione, e in ultimo, ma di fondamentale importanza, la sensibilità e la specificità di questa metodica in termini di predizione diagnostica raggiungono il 95%, suggerendo quindi che un singolo esperimento potrebbe sostituire tutte le altre metodiche attualmente utilizzate per un corretto inquadramento diagnostico.
Il nostro gruppo è, insieme al gruppo di Padova, uno dei centri partecipanti a questo ambizioso progetto ed ha pertanto avuto l’opportunità di analizzare il profilo di espressione genica di più di 300 adulti affetti da LAL all’esordio di malattia. Sebbene la I parte di questo progetto sia ormai completa, è realistico che il profilo di espressione genica verrà eseguito su tutti i pazienti arruolati nei protocolli GIMEMA (Gruppo Italiano Malattie EMatologiche dell’Adulto) delle LAL dell’adulto; infatti, sono emerse delle evidenze che rappresentano il razionale anche del progetto corrente, che mostrano chiaramente che nell’ambito delle LAL-T è possibile identificare sottogruppi di pazienti con LAL-T non definiti precedentemente.
Tra questi sottogruppi, il primo presenta caratteristiche immunofenotipiche sovrapponibili a quelle delle altre LAL-T, ma è caratterizzato dall’iperespressione di geni solitamente associati alle leucemie acute mieloidi, come ad esempio la MPO, il CD14, il CD11b, e numerosi enzimi lisosomiali. Questi risultati suggeriscono che vi sia una deregolazione di uno o più fattori di trascrizione che concorrono a determinare questo comportamento: in particolar modo, è stato recentemente dimostrato che nelle leucemie acute mieloidi (LAM) la downmodulazione di CEBPA porta alla up-regolazione di numerosi geni appartenenti alla linea linfoide T. E’ plausibile quindi che in questi casi vi sia un’alterazione genetica e/o epigenetica che porta alla upregolazione di geni della linea mieloide; a supportare questa ipotesi, l’espressione di CEBPA è molto più elevata in questi casi di LAL-T rispetto ai rimanenti pazienti. In alternativa, un’altra ipotesi ammissibile è che un miR (o più miR) sia espresso in maniera aberrante in questi campioni; in particolar modo, è stato recentemente dimostrato che miR-223 regola i livelli di espressione di CEBPA, e di conseguenza i due processi potrebbero essere strettamente interconnessi. Entrambe le ipotesi verranno ampiamente investigate.
Il secondo sottogruppo di LAL-T è caratterizzato dalla concomitante iperespressione del gene p53 e da numerosi geni che svolgono un ruolo importante nel ciclo cellulare. In questi pazienti, p53 verrà analizzato in dettaglio per cercare eventuali mutazioni negli esoni più frequentemente interessati (esoni 5, 6 7 e 8) e, contestualmente i livelli di espressione genica e proteica verranno analizzati. Inoltre, i livelli di proliferazione dei blasti leucemici di questi pazienti verranno (laddove possibile) valutati, mediante analisi del contenuto di DNA ed RNA nelle diverse fasi del ciclo cellulare.
Infine, il terzo sottogruppo di LAL-T comprende il 13% circa dei casi ed è caratterizzato dalla iperespressione di geni appartenenti alla famiglia degli Homeobox A (HOXA). In alcuni pazienti è già stato possibile evidenziare la lesione molecolare sottostante a tale fenomeno: trattasi in un caso del riarrangiamento CALM/AF10 e in altri due casi di un riarrangiamento a carico del gene ALL1. tuttavia, negli altri pazienti non è stato possibile identificare la causa di questo comportamento biologico.
Un altro punto che verrà svolto nel corso di questo progetto è l’analisi dei miR nelle LAL: questa analisi verrà svolta tanto nell’ambito delle LAL-B che LAL-T, con il fine di identificare un set di miR che siano associati alla presenza delle diverse aberrazioni molecolari, e se possibile, miR che siano causali di LAL.
PAZIENTI. Gli studi del profilo di espressione genica rappresentano un mezzo importante ed innovativo per l’identificazione di geni differenzialmente espressi nei diversi sottogruppi leucemici in esame. Una appropriata analisi di profilo genico richiede un numero di campioni adeguato: ciò rappresenta un prerequisito indispensabile per l’ottenimento di risultati che siano statisticamente significativi, e dunque buoni candidati per successivi studi di validazione. In questo contesto, il nostro gruppo è coinvolto da 10 anni circa in un esteso progetto di centralizzazione ed uniforme caratterizzazione biologica di pazienti adulti affetti da LAL arruolati nei protocolli multicentrici GIMEMA. Parte integrante di questo progetto è la criopreservazione di materiale biologico (RNA, DNA, lisati proteici e cellule vitali criopreservate in DMSO). Ad oggi, inoltre, gli acidi nucleici (RNA e DNA) vengono immediatamente estratti dalle cellule leucemiche di campioni all’esordio, e destinati esclusivamente a studi di genomica. La presenza di un network che opera su base nazionale facilita notevolmente l’ottenimento di un’appropriata campionatura dei diversi gruppi da analizzare. Più nel dettaglio, tutti pazienti adulti inseriti nei diversi protocolli GIMEMA verranno inseriti nello studio del profilo di espressione genica.
ALLESTIMENTO DEI CAMPIONI, SEPARAZIONE DELLE CELLULE E PREPARAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI. La separazione del materiale leucemico da analizzare verrà eseguita con metodiche standard, ovvero mediante gradiente di densità (Lymphoprep). Al momento, non sono previste separazioni immuno-magnetiche per lo studio del profilo di espressione genica, poiché la popolazione residua contaminante è generalmente scarsa (inferiore al 25%). Al contrario, una separazione delle varie sottopopolazioni cellulari potrebbe essere richiesta per lo studio dei miR. Gli acidi nucleici verranno estratti partendo da cellule leucemiche di sangue periferico o midollare a seconda della percentuale di blasti del campione.
L’RNA verrà estratto o secondo procedure standard, mediante l’impiego del TRizol (Invitrogen) o mediante l’impiego di kit commerciali (Qiagen). L’estrazione dell’RNA è condizione indispensabile per lo studio del profilo di espressione genica e del profilo di espressione dei miR: una doppia estrazione è necessaria poiché i miR, essendo molecole di piccola taglia, possono rimanere intrappolate nel silice delle colonne. Il DNA verrà estratto usando kit commerciali (Wizard Genomic DNA purification kit, Promega), ed è necessario per l’integrazione con analisi complementari come ad esempio la CGH e l’array-CGH e il sequeziamento di alcuni geni in particolar modo p53 e CEBPA. Il tempo previsto per la raccolta del materiale biologico è di 3-6 mesi.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER L’ANALISI DEL PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA. Per la preparazione dei microarrays verranno seguite le linee guida stabilite nell’ambito del progetto MILE. In tutti i casi, l’RNA verrà estratto da materiale cellulare non criopreservato. Il tempo previsto è contestuale a quello della raccolta del materiale biologico ed è quindi di 3-6 mesi.
VALIDAZIONE DEI RISULTATI OTTENUTI MEDIANTE PCR-QUANTITATIVA. Una volta identificati i geni di interesse, è importante convalidare i risultati mediante altre metodiche. La PCR quantitativa (Q-PCR) rappresenta la strategia di elezione: i primers per i diversi geni verranno disegnato usando Primers Express (Applied Biosystems), e la Q-PCR verrà effettuata usando il reagente Sybrgeen (Applied Biosystems). Sebbene questo sistema possa dare a volte dei risultati di dubbia interpretazione per la presenza di picchi aspecifici, verrà eseguita in tutti i casi una curva di dissociazione per escludere questa evenienza. Il tempo previsto è di 2 mesi.
SEQUENZIAMENTO GENICO. Il sequenziamento genico verrà effettuato partendo da DNA genomico su due geni in particolare: CEBPA, al fine di comprendere se i pazienti che presentano un profilo di espressione genica “simil-mieloide” ed esprimono contestualmente alti livelli di CEBPA, presentano mutazioni a carico dello stesso CEBPA e che potrebbero attivare il suddetto gene, come da nostra ipotesi. Il secondo gene che verrà sequenziato è p53, al fine di valutare se i campioni che all’analisi ne esprimono alti livelli presentino mutazioni. Mediante sequenziamento, verranno valutati gli esoni 5, 6, 7 ed 8, che sono più spesso mutati; tuttavia, ci proponiamo di valutare questi campioni anche mediante i “p53 arrays”, prodotti dalla RMS, che da dati preliminari risultano essere più sensibili rispetto alla metodiche di sequenziamento standard. Il tempo previsto è di 4 mesi.
INTEGRAZIONE CON METODICHE DI CITOGENETICA NON CONVENZIONALE. Come più volte accennato, la genomica sta fornendo risultati molto incoraggianti; tuttavia, l’esclusivo impiego dell’analisi del profilo di espressione genica potrebbe avere un utilizzo in campo diagnostico, ma non nella ricerca, in quanto la complementarità tra le diverse metodiche è chiaramente una conditio sine qua non per la comprensione dei meccanismi che portano allo sviluppo della leucemia. Pertanto, i dati delle LAL-T dell’adulto ottenuti con il profilo di espressione genica verranno confrontati con quelli di FISH, array-CGH e CGH che verranno generati, sulla stessa coorte di pazienti, da un altro gruppo di ricerca afferente a questo progetto.
ANALISI DEL PROFILO DEI MIR. L’analisi dei miR verrà effettuata su tutti i pazienti che saranno arruolati in questo progetto a prescindere dalle caratteristiche immunofenotipiche (sia LAL-T che LAL-B). Verranno impiegati due approcci. Il primo approccio è un array, che consente di quantificare una lista di miR, ricavata dalla versione più aggiornata del database Sanger miRBase e include circa 450 miR, e viene effettuata dalla core facility della LC Sciences (Houston, Texas) partendo da 10ug di RNA totale. La procedura richiede i seguenti passaggi: arricchimento degli RNA di piccola taglia, marcatura con fluorescenza singola, ibridizzazione, acquisizione dell’immagine mediante scanner e analisi dei dati. I risultati ottenuti forniranno un quadro complessivo relativo ai miR che sono maggiormente espressi o down-regolati nelle LAL.
Il secondo approccio verterà su metodiche di Q-PCR per validare in un casistica più ampia, i risultati ottenuti con gli arrays. Inoltre, verrà effettuata, a prescindere dai risultati ottenuti con gli arrays, la quantizzazione di miR-223 nei pazienti che presentano un profilo di espressione genica “simil-mieloide”, al fine di valutare se esiste una correlazione tra il profilo genico osservato, i livelli di CEBPA e il miR-223. Il tempo previsto è di 5 mesi.
ANALISI STATISTICA. L’analisi statistica rappresenta una delle parti più complesse e laboriose del profilo di espressione genica. Nelle precedenti procedure sperimentali (i.e. Northern blotting, PCR qualitativa e quantitativa), un numero limitato di geni veniva investigato in un gruppo più o meno ampio di pazienti; al contrario, la tecnica dei microarrays implica l’acquisizione di informazioni quantitative relative all’espressione di un elevato numero di geni in una casistica di pazienti relativamente ristretta. Questo sovvertimento della strutturazione dei metodi sperimentali implica obbligatoriamente la necessità di designare nuovi sistemi per l’analisi dei dati acquisiti. Per tale motivo, numerosi software sono stati ideati esclusivamente per l’analisi dei dati del profilo genico. Tali programmi si basano generalmente sulla combinazione di nozioni prettamente statistiche con informazioni di tipo bioinformatico. In questo studio, verranno utilizzati diversi software, con lo scopo di adempiere a più funzioni: per la normalizzazione - processo finalizzato alla standardizzazione di tutti gli esperimenti e alla minimizzazione della variabilità intersperimentale- e per la selezione di geni che presentino un sufficiente grado di espressione e di variabilità, verrà impiegato il programma DNA-chip analyzer (www.dchip.org). Per l’analisi statistica verrà utilizzato l’R-package (www.r-project.org), che consente di effettuare diversi tests, come ad esempio il t-test, l’analisi della varianza (ANOVA), la false discovery rate (FDR), il p-value adjustment, ecc. Questi test statistici rivestono estrema importanza nel ridurre la possibilita’ di selezionare geni solo “casualmente” significativi, fenomeno che si verifica quando il numero di variabili in esame è estremamente elevato. In aggiunta, verranno utilizzati altri programmi (Cytoscape, www.cytoscape.org, GenMapp, www.genMAPP.org, e David, www.david.abcc.ncifcrf.gov) per l’esplorazione di pathways funzionali e l’integrazione di essi con i dati di profilo di espressione genica.
Infine, nel tentativo di integrare i dati di profilo genico con quello dei miR, verranno impiegate diversi tecniche computazionali, basate fondamentalmente sul calcolo di coefficiente di correlazione tra miR e profilo genico degli RNA. Per far ciò, si farà riferimento a diversi database (TargetScan e PicTar) che, mediante predizioni computazionali, forniscono una lista potenziale di geni targets per ogni singolo miR. Il tempo previsto per lo svolgimento di questa analisi è di 12 mesi.
CORRELAZIONE CON L’ANDAMENTO CLINICO. Come ovvio, il fine ultimo del corrente progetto è l’identificazione di pazienti con andamento clinico diverso, che potrebbero giovarsi di trattamenti terapeutici alternativi.
Il GIMEMA data center raccoglie tutte le informazioni cliniche relative ai pazienti inseriti nei diversi protocolli multicentrici: di conseguenza, le informazioni biologiche ottenute nello svolgimento di questo progetto verranno correlati con diversi parametri clinici (età, numero di globuli bianchi, presenza di masse, ecc.) e con la risposta alla terapia di induzione e il follow-up a lungo termine.
Infine, è opinabile che queste caratteristiche abbiano anche un impatto clinico e consentano in ultimo di: 1) stratificare al meglio i pazienti adulti affetti da LAL-T, gruppo che fino ad oggi è stato considerato omogeneo; 2) designare regimi terapeutici mirati e differenziati.