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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

UNITA' DI RICERCA

italiano - english
Bibliografia
1. Pui CH, Relling MV, Downing JR. Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 2004 Apr 8;350(15):1535-48
2. Downing JR, Shannon KM. Acute leukemia: a pediatric perspective. Cancer Cell. 2002 Dec;2(6):437-45.
3. Yeoh EJ, Ross ME, Shurtleff SA et al. Classification, subtype discovery, and prediction of outcome in pediatric acute lymphoblastic leukemia by gene expression profiling. Cancer Cell. 2002;1:133-143.
4. Ferrando AA, Neuberg DS, Staunton J et al. Gene expression signatures define novel oncogenic pathways in T cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell. 2002;1:75-87.
5. Kohlmann A, Schoch C, Schnittger S et al. Molecular characterization of acute leukemias by use of microarray technology. Genes Chromosomes Cancer. 2003;37:396-405.
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8. Ross ME, Mahfouz R, Onciu M et al. Gene expression profiling of pediatric acute myelogenous leukemia. Blood. 2004;104:3679-3687.
9. Schoch C, Kohlmann A, Schnittger S et al. Acute myeloid leukemias with reciprocal rearrangements can be distinguished by specific gene expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:10008-10013.
10. Ross ME, Mahfouz R, Onciu M, et al. Gene expression profiling of pediatric acute myelogenous leukemia. Blood. 2004;104, 3679–3687.
11. Torsten Haferlach, Alexander Kohlmann et al. An International Multi-Center Study To Define the Application of Microarrays in the Diagnosis and Subclassification of Leukemia (MILE Study): Interim Analysis Based on 1,889 Patients Achieves 95.4% Prediction Accuracy. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), Nov 2006; 108: 103.
12. Campo Dell'Orto M, Zangrando A, Trentin L, Li R, Liu WM, te Kronnie G, Basso G, Kohlmann A New data on robustness of gene expression signatures in leukemia: comparison of three distinct total RNA preparation procedures. BMC Genomics. 2007 Jun 22;8:188
13. Torsten Haferlach, Alexander Kohlmann et al. An International Multi-Center Study To Define the Application of Microarrays in the Diagnosis and Subclassification of Leukemia (MILE Study): Analysis of completed stage I with 2030 patients achieved 95.4% accuracy. ASH Annual Meeting Abstracts 2007.
14. Stam WAG, Beverloo HB et al. Incidence of additional genetic changes in the TEL and AML1 genes in DCOG and COALL-treated t(12;21)-postive pediatric ALL, and their relation with drug sensitivity and clinical outcome. Leukemia 2006; 20: 410-416.
15. Forestier E, Anderson MK et al. Cytogenetic patterns in ETV6/RUNX1-positive pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia: a Nordic series of 245 cases and review of the literature. Genes Chromosomes Cancer 2007; 46: 440-450.
16. Lu XY, Harris CP et al. The utility of special karyotyping in the cytogenetic analysis of newly diagnosed pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2002; 16:2222-2227.
17. Martineau M, Jalali GR et al. EVT6/RUNX1 fusion at diagnosis and relapse: some prognostic indications. Genes Chromosomes and Cancer 2005; 43: 54-71.
18. Nordgren A, Heyman M et al. Spectral karyotyping and interphase FISH reveal abnormalities not detected by conventional G-banding. Implications for treatment stratification of childhood acute lymphoblastic leukemia: detailed analysis of 70 cases. Eur J heamatol. 2002; 68:31-41.
19. Lilljebjorn H, Heidenblad M et al. Combined high-resolution array-based comparative genomic hybridization and expression profiling of ETV6/RUNX1-positive acute lymphoblastic leukemias reveal a high incidence of cryptic Xq duplications and identify several putative target genes within the common gained region. Leukemia 2007; 21: 2137-2144.
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Programma di ricerca

Nuove frontiere nella stratificazione delle leucemie acute linfoidi (LAL): integrazione tra citogenetica non-convenzionale, genomica e post-genomica
Università di riferimento
Università degli Studi di PADOVA - PEDIATRIA - ()
Responsabile dell'Unità di ricerca
Giuseppe Basso
Descrizione
Introduzione
Durante gli ultimi due anni, in uno studio integrato tra diversi laboratori per l'uso innovativo dei microarray nella leucemia, il nostro gruppo ha prodotto i dati di espressione genica di 400 campioni di LAL. Questi dati di espressione genica possono fungere da base per futuri studi nel nostro laboratorio. L’obiettivo del nostro studio è l’esame delle aberrazioni genomiche criptiche all'interno delle sottoclassi LAL allo scopo di trovare nuovi geni che contribuiscono alla classificazione di leucemia e a migliorare la stratificazione dei pazienti. La dimensione del campione è un fattore fondamentale in questo studio: poiché la frequenza delle anomalie ricorrenti neo-identificate è bassa, abbiamo bisogno di testare un elevato numero di campioni. A tale scopo saranno analizzati 400 campioni di LAL.
Poichè la limitata risoluzione delle tecniche di analisi del cariotipo classico e della FISH non permette l’identificazione di aberrazioni cromosomiche criptiche, con possibile importanza prognostica e patogenica, applicheremo in questo studio l’analisi di SNP array e CGH array. I due metodi sono complementari e mostrano l'alta concordanza fra SNP array e CGH array nell'analisi del numero di copie dei geni. Nel nostro laboratorio applicheremo i CGH array sul DNA degli stessi campioni con LAL per i quali sono stati analizzati i dati di espressione genica. Dopo aver individuata una prima serie di campioni con lesioni genotipiche, i pazienti selezionati verranno usati per analizzare i profili di espressione rispetto al campione che non ha mostrato la medesima lesione. L’analisi sistematica ed integrata dei profili di espressione genotipica e genica, effettuata su una grande coorte di pazienti con LAL, permetterà di rilevare nuovi geni in grado di migliorare l’attuale stratificazione delle B-LAL.

Aspetti innovativi
L'ibridazione comparativa basata sugli array ad alta risoluzione (CGH-array), insieme alla tecnologia degli SNP-array, permetterà di rilevare molte informazioni genetiche nelle LAL. L’analisi del profilo genetico tramite SNP array e CGH array sarà effettuata su un gruppo di campioni precedentemente analizzati con array di espressione. Verranno successivamente correlati i profili genotipici con l’espressione genica, in modo da identificare se le lesioni genetiche criptiche secondarie comportino una modificazione del profilo genico della cellula. Questo studio sistematico potrebbe comportare una migliore classificazione prognosticamente rilevante per i sottogruppi di LAL. Con questo approccio di analisi cercheremo non soltanto di identificare nuove lesioni, ma profili differenti di espressione generati da queste anomalie, direttamente e indirettamente. Un effetto indiretto è stato evidenziato in un nostro studio precedente su 28 campioni B-LAL in cui è stato scoperto un collegamento fra la delezione di 9p21 (implicando una ridotta espressione del gene regolatore P16) e la down-regolazione inaspettata del gene SMAD1 (non implicato nella delezione), che quindi collega questi due geni nella via di BMP.

Fattibilità
L'apparecchiatura presente nel nostro laboratorio è adeguata: citometri a flusso, sorter cellulare, una piattaforma microarray di Affymetrix, uno scanner array 4000XL/Packard, 2470 Arrayer Aushon Biosystems, Taqman ABIPrims 7900 e computer con diversi software di analisi per grandi serie di dati. La fattibilità del nostro progetto è garantita dall'esperienza dei ricercatori componenti il gruppo, comprovata da uno studio precedentemente realizzato sui file di espressione di 400 campioni di LAL pediatriche. I membri del gruppo hanno esperienza di biologia cellulare, biologia molecolare, studi clinici, citometria, statistica, bioinformatica e manualità specifica nell'utilizzo dei microarray della piattaforma Affymetrix e delle analisi dei dati genomici, sia di espressione genica che di numero delle copie dei geni.

Fasi del progetto
I due anni del progetto verranno suddivisi nelle seguenti fasi (si veda la gantt chart per visualizzare le tempistiche e le sovrapposizioni tra le fasi):



Fase I: Selezione dei campioni in base ai risultati dell'analisi semi-supervisionata sui profili di espressione genica applicata all'intero insieme di dati genomico. Raccolta dei campioni dalla banca biologica per l'estrazione del DNA.

Fase II: Analisi tramite array CGH ad alta risoluzione sui sottotipi B-LAL alla ricerca di nuove lesioni genomiche ricorrenti.

Fase III: Integrazione delle analisi di espressione genotipica e genica, considerando la suddivisione dei pazienti in base alle lesioni secondarie neo-identificate per trovare nuovi presunti geni bersaglio per la patogenesi della laucemia tramite analisi supervisionata

Fase IV: Analisi comparativa (I) sul numero delle copie geniche utilizzando le metodiche SNP e CGH

Fase V: Analisi comparativa (II) di dati di pazienti adulti e pediatrici per sottotipi di leucemia già noti e per aberrazioni genomiche ricorrenti neo-identificate

Fase VI: Riassunto e presentazione del manoscritto con i risultati ottenuti dalle precedenti fasi dello studio e sottomissione del manoscritto per la pubblicazione.




Fase I
Selezione dei campioni
L'analisi dei profili di espressione genica sarà utilizzata per migliorare le attuali classificazioni delle LAL e per cercare correlazioni con le lesioni recentemente identificate. In questa prima fase dello studio utilizzeremo il software Partek Genomics SuiteTM (Partek GS), un programma completo di statistica avanzata e visualizzazione interattiva dei dati creato appositamente per estrarre informazioni biologiche dall'analisi di dati di espressione genica. Applicheremo analisi supervisionate sui dati di espressione genica ai seguenti sottotipi: B-LAL con traslocazione t(8;14), pro-B-LAL con t(11q23)/MLL, c-LAL/pre-B-LAL con t(9;22), T-LAL, ALL con t(12;21), LAL con t(1;19), LAL con cariotipo iperdiploide e c-LAL/Pre-B-LAL senza aberrazioni. Verrà utilizzata una piattaforma Affymetrix ed il GeneChip per il genoma umano HG-U133 Plus 2.0 (47000 trascritti; le sonde utilizzate derivano dalle sequenze selezionate da GenBank, dbEST e RefSeq) su campioni con leucemia di tipo LAL. Applicando un'indagine non-supervisionata, ciascuna classe di leucemia verrà analizzata per trovare ulteriori sottogruppi. Questi sottogruppi possono essere correlati con la presenza di lesioni secondarie che intendiamo identificare con l'analisi genotipica. La classe leucemica con la più alta probabilità di formare sottogruppi guiderà la scelta della prima serie di campioni che saranno analizzati con la tecnica CGH. I DNA dei rispettivi campioni saranno estratti dai campioni cellulari e depositati nella banca biologica.


Fase II:
Metodica CGH (aCGH) ad alta risoluzione
Per identificare alterazioni cromosomiche nel genoma umano con alta risoluzione, utilizzeremo la piattaforma oligo-aCGH di Agilent analizzando il DNA dei campioni selezionati (Fase I). Useremo il CGH Microarray Kit 244 di Agilent per il genoma umano, un array per lo studio delle variazioni sul DNA sull'intero genoma, senza amplificazione o ridimensionamento della complessità. La copertura complessiva delle sonde interessa sia le regioni codificanti che le regioni non-codificanti, in particolare i geni con importanza già nota, promotori, miRNA e regioni telomeriche. Il disegno e la selezione delle sonde sono stati accuratamente ottimizzati e validati per avere massima sensibilità e specificità, ottenendo una piattaforma con più di 236000 sequenze codificanti e non-codificanti nel genoma umano UCSC hg17 (NCBI versione. 35, Maggio 2004) ed una risoluzione media di sonde nello spazio di 6.4KB. Le sonde nei microarray aCGH di Agilent sono oligonucleotidi 60-meri sintetizzati usando la tecnologia inkjet SurePrintTM di Agilent, la quale assicura sonde oligonucleotidiche conformi e ad alta qualità. Le sonde rappresentate sul microarray aCGH di Agilent per genoma umano sono state selezionate utilizzando algoritmi sviluppati appositamente per applicazioni con aCGH, ottimizzando quindi la capacità delle sonde stesse di identificare cambiamenti nel numero di copie geniche. I profili di aCGH per campioni con LAL saranno analizzati alla ricerca di lesioni ricorrenti, delezioni ed amplificazioni. Le successive serie di campioni saranno selezionate da altri sottotipi di B-LAL per estendere le analisi a tutti i sottogruppi e studiarne i rispettivi profili di espressione.


Fase III
Integrazione delle analisi di espressione genotipica e genica
In un nostro precedente studio su 28 pazienti con B-LAL, abbiamo applicato con successo un'analisi integrativa per dati di espressione genotipica e genica in cui venivano confrontati campioni con e senza la delezione 9p21. In breve, questo approccio utilizza statistiche e visualizzazioni interattive dei dati utilizzando il software Partek GS, grazie a cui possiamo confrontare dati di espressione dell'intero genoma arricchiti delle informazioni di espressione "a livello esonico" (si veda la Figura 1 per gli studi in corso nel nostro laboratorio) con dati sulla variazione del numero di copie nel genoma con metodiche di analisi con SNP e aCGH. Per trovare geni di particolare interesse saranno applicate analisi di tipo supervisionato e non-supervisionato. L'analisi di tipo supervisionato si basa su una statistica di comparazione tra gruppi. Poiché la presenza di lesioni genomiche secondarie neo-identificate comporta una suddivisione dei campioni in due sottogruppi (ad esempio con e senza delezione 9p21), l'indagine supervisionata verrà applicata per identificare i geni significativamente espressi in maniera differenziale tra i due gruppi utilizzando una statistica basata sul t-test gene per gene. Verrà inoltre applicata l'analisi discriminante (LDA, Partek GS) per la creazione di un classificatore. Saranno utilizzati algoritmi di riduzione della dimensionalità del dato (PCA, analisi delle componenti principali) e di raggruppamento gerarchico (clustering) per l'indagine di tipo non-supervisionato (si veda anche la Fase I di questo progetto).

Fase IV
Analisi comparativa I
In stretta collaborazione col gruppo del Prof. A.Biondi (Clinica Pediatrica dell’Università di Milano-Bicocca, in Monza), applicheremo l’analisi di SNP (GeneChip Human Mapping 100K Array) e di aCGH (Agilent Human Menome CGH Microarray Kit 244) per confrontare l’accuratezza delle due metodiche nell’identificare le variazioni sul numero delle copie geniche. Dati preliminari hanno dimostrato un’alta concordanza tra le due tecniche nel trovare lesioni genomiche secondarie di recente identificazione. La corretta scelta dei campioni che saranno utilizzati per lo studio di comparazione sarà definita in base ai primi risultati delle analisi con SNP e aCGH. Abbiamo stimato un numero di 30 campioni per questo studio di comparazione.


Fase V
Analisi comparativa II
In collaborazione col gruppo del Prof. R.Foa (Università di Roma “La Sapienza”), confronteremo i dati ricavati da pazienti adulti e pediatrici per tutte le sottoclassi LAL (in relazione ai risultati ottenuti nel progetto MILE) per trovare differenze nei profili di espressione genica tra campioni adulti e pediatrici appartenenti allo stesso sottotipo (B-LAL con t(8;14), pro-B-LAL con t(11q23)/MLL, c-LAL/pre-B-LAL con t(9;22), T-LAL, LAL con t(12;21), LAL con t(1;19), LAL con cariotipo iperdiploide e c-LAL/Pre-B-LAL senza le aberrazioni indicate). Attualmente guariscono circa l’80% dei pazienti pediatrici contro il 30-40% degli adulti con LAL: questa discrepanza può essere solo in parte spiegata dall’alta frequenza di aberrazioni genomiche sfavorevoli nella LAL dell’adulto. Un’analisi comparativa dei profili di espressione genica nello stesso sottotipo LAL può aiutare a capire le differenze nella risposta al trattamento in pazienti pediatrici ed adulti, e conseguentemente migliorare la stratificazione dei pazienti. Il confronto tra i dati di campioni pediatrici ed adulti sarà effettuato nel secondo anno del nostro studio per poter inserire nella comparazione anche i dati sulle lesioni secondarie neo-identificate.


Fase VI
Riassunto / Preparazione del manoscritto
Stimiamo che alla fine di questo studio il materiale raccolto sarà sufficiente per la stesura di almeno due manoscritti scientifici completi da presentare ai giornali accademici per la pubblicazione. Gli attuali rapporti tra i vari gruppi di ricerca dovrebbero garantire un’efficace collaborazione e fruttuose discussioni sui risultati ottenuti nel corso dello studio.


Conclusioni
1. Utilizzando le tecnologie ad alta risoluzione di SNP ed aCGH, troveremo aberrazioni genomiche secondarie finora non identificate con possibile importanza prognostica e patogenica per la stratificazione delle LAL.
2. La presenza di queste lesioni sarà utilizzata per suddividere i campioni nell’analisi differenziale di espressione genica, alla ricerca di possibili marcatori legati alla patogenesi della leucemia.
3. Il confronto di campioni adulti e pediatrici dello stesso sottotipo LAL permetterà di identificare differenze nell’espressione genica che potrebbero migliorare la stratificazione dei pazienti.